不可分型流感嗜血杆菌F蛋白与脂蛋白（a）的相互作用

发布时间：2017-09-07 22:43

  本文关键词：不可分型流感嗜血杆菌F蛋白与脂蛋白（a）的相互作用

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【摘要】：F蛋白(Protein F, PF)是不可分型流感嗜血杆菌(nontypeable Haemophilus influenzae, NTHi)表面的一种纤溶酶原(Plasminogen, Plg)受体。Pig利用自身的赖氨酸结合位点(LBS)与PF相结合。脂蛋白(a)[lipoprotein(a), Lp(a)]中的载脂蛋白[apolipoprotein(a), Apo(a)]与Pig高度同源,其KIV10结构域含有高亲和力的LBS。基于此,本实验提出Lp(a)可能与NTHi上的PF相结合,从而竞争性的抑制PF与Pig的结合。本实验利用多种方法检测了重组PF (rPF)以及缺失末端赖氨酸残基的PFAk (rPF△k)与Pig、Lp(a)的相互作用。首先利用大肠杆菌BL21诱导表达得到了rPF及rPF△k,并利用亲和填料进行了纯化。然后通过ELISA结合及抑制试验检测了rPF及rPF△k与Pig、Lp(a)的相互作用。结合试验结果显示：rPF能够与Pig、Lp(a)结合,且rPF组与Pig、Lp(a)的结合值显著高于rPF△k组。抑制试验结果如下：1)EACA能够抑制rPF与Pig、Lp(a)的结合,当浓度达到2 mmol/L时EACA对rPF与Pig结合的抑制作用显著增强。与此同时,ECAC对rPF与Lp(a)结合的抑制作用在其浓度为0.2 mmol/L时就明显增强；2)当Lp(1a)浓度达到50 ng/100gL时,能够显著的抑制rPF与Pig的结合。此外,本实验利用亲和层析和Western blot也证明了rPF与Pig、Lp(a)的特异性结合主要是由Pig、Lp(a)的LBS与rPF羧基末端的赖氨酸残基相互作用形成的。Lp(a)能够竞争性的抑制rPF与Pig的结合,这表明Lp(a)在抗NTHi感染过程中可能具有一定的作用。
【关键词】：不可分型流感嗜血杆菌 纤溶酶原 脂蛋白(a) F蛋白
【学位授予单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R378
【目录】：

• 摘要3-4
• abstract4-8
• 缩略语表8-9
• 1 引言9-16
• 1.1 流感嗜血杆菌及其表面的纤溶酶原受体9-10
• 1.2 Plg-Pm系统10-13
• 1.2.1 Plg、Pm的组成及构象10-11
• 1.2.2 Plg、Pm的功能11
• 1.2.3 PA简介11-12
• 1.2.4 纤溶酶原激活剂抑制剂(Plasminogen activate inhibitors,PAIs)12-13
• 1.2.5 Pm抑制剂13
• 1.3 人血浆Lp(a)13-15
• 1.3.1 Lp(a)的结构13-14
• 1.3.2 Lp(a)的功能作用14-15
• 1.4 立题依据15
• 1.5 研究内容15-16
• 2 材料与方法16-27
• 2.1 实验材料16-18
• 2.1.1 仪器设备16
• 2.1.2 化学试剂16-17
• 2.1.3 质粒和菌株17
• 2.1.4 培养基17
• 2.1.5 化学贮存液17-18
• 2.1.6 PCR引物18
• 2.2 实验方法18-27
• 2.2.1 NTHi ATCC49247基因组DNA的提取及鉴定18
• 2.2.2 NTHi表面hpf、hpf△k基因的扩增18-19
• 2.2.3 pGEX-6p-1质粒的提取19
• 2.2.4 载体及片段的酶切、纯化及连接转化19-21
• 2.2.5 阳性菌筛选21-22
• 2.2.6 阳性菌落的扩大培养及菌种保存22
• 2.2.7 基因序列的测定22
• 2.2.8 工程菌的培养及诱导表达22-23
• 2.2.9 表达产物的SDS-PAGE分析23
• 2.2.10 重组蛋白rPF、rPF△k的纯化23-24
• 2.2.11 目的蛋白标签的切除24
• 2.2.12 标签切除效果的Western-blot检测24-25
• 2.2.13 酶联免疫吸附试验(ELISA)检测rPF、rPF△k与Plg、Lp(a)的结合25-26
• 2.2.14 ELISA检测EACA对rPF与Plg、Lp(a)结合的抑制26-27
• 3 结果27-36
• 3.1 NTHi ATCC49247基因组的提取27
• 3.2 目的基因的扩增27-28
• 3.2.1 hpf基因的扩增27-28
• 3.2.2 hpf△k扩增结果28
• 3.3 质粒的提取28
• 3.4 质粒及目的片段酶切结果28-29
• 3.5 菌落PCR结果29
• 3.6 工程菌表达产物的SDS-PAGE分析29-31
• 3.6.1 rPF小量表达结果29-30
• 3.6.2 rPF△k小量表达结果30-31
• 3.7 重组蛋白的纯化31-32
• 3.7.1 rPF纯化结果31
• 3.7.2 rPF△K纯化结果31-32
• 3.8 目的蛋白标签的切除及纯化32-33
• 3.8.1 rPF标签的切除32
• 3.8.2 rPF△K标签的切除32-33
• 3.9 标签切除效果的Western blot检测33
• 3.10 ELISA检测rPF、rPF△k与Plg、Lp(a)的结合33-34
• 3.11 亲和色谱层析检测rPF、rPF△k与Lp(a)的结合34
• 3.12 ELISA检测EACA对rPF与Plg、Lp(a)结合的抑制34-35
• 3.13 ELISA检测Lp(a)对rPF与Pig结合的抑制35-36
• 4 讨论36-37
• 5 结论37-38
• 致谢38-39
• 参考文献39-45
• 作者简介45

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本文编号：810320