GP73参与内质网应激引起的脂质代谢紊乱的机制研究

发布时间：2017-09-08 13:29

  本文关键词：GP73参与内质网应激引起的脂质代谢紊乱的机制研究

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【摘要】：内质网应激是内质网功能的内稳态失衡时的状态。许多因素都可以导致内质网应激,包括细胞内未折叠蛋白增多、钙代谢紊乱、缺血再灌注损伤、氧化应激、化学物质处理、卵磷脂合成障碍等,其中未折叠蛋白增多是最常见也最重要的一种因素。未折叠蛋白增多能够激活细胞启动未折叠蛋白质反应(unfolded protein response,UPR),UPR可以通过减少蛋白的合成、加速蛋白的降解、增强蛋白的折叠或者增加脂质的合成来缓解内质网应激,使内质网功能恢复稳态。已经有大量文献报道内质网应激与脂代谢异常类疾病的发生相关,如非酒精性脂肪肝病(Non alcoholic fatty liver disease,NAFLD),然而内质网应激在脂代谢异常中所起的作用尚不清楚,但已经明确的是固醇调节元件结合蛋白质(sterol regulatory element binding proteins,SREBPs)是内质网应激导致脂质合成的关键转录因子。SREBPs是一种重要的脂质稳态转录调节因子。正常情况下,没有活性的前体SREBPs与固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白(SREBP cleavage activating protein,SCAP)结合,定位于内质网膜。当细胞内固醇含量减少时,SREBPs/SCAP复合体转移至高尔基体,在高尔基体被site 1蛋白酶(S1P)与site 2金属酶(S2P)切割后,它的活性端将释放进入细胞核,促进脂质合成相关基因的转录活性;当细胞中固醇水平较高时,胰岛素诱导基因(insulin induced gene proteins,Insig)则与SCAP/SREBPs发生相互作用,抑制SREBPs向高尔基体的转运及活性形式的形成。高尔基体糖蛋白73(Golgi Protein 73,GP73)又叫GOLM1(golgi membrane protein 1)或者GOLPH2(golgi phosphoprotein 2),是一种定位于高尔基体的Ⅱ型跨膜糖蛋白。GP73在人体正常肝组织的肝细胞中表达很少甚至不表达,但近几5年发现在很多肝脏疾病中其表达上调。我们前期研究发现GP73能够诱发胆固醇相关基因表达上调,而且GP73能与SCAP及SREBPs发生相互作用,推测GP73很有可能通过SCAP/SREBPs促进脂质相关基因的表达,参与内质网应激诱导的SREBPs脂质代谢通路。在本研究中,通过体内外模型的构建以及相关指标的检测发现:1.GP73可以通过参与SCAP SREBPs脂代谢通路调控脂质代谢:我们在Hep G2细胞中利用IP、WB技术检测了GP73与SCAP及SREBP1的相关性,免疫荧光检测了SCAP在细胞内的定位,q PCR技术检测脂代谢相关基因表达,发现(1)GP73能够与SCAP及SREBP1发生相互作用;(2)过表达GP73可以增强SCAP、SREBPs的表达;(3)GP73能够促进SCAP在高尔基体的定位以及SCAP与SREBPs的相互作用;(4)过表达GP73能上调脂代谢相关基因基因的表达,如acety Co A、FASN、HMGCS1、HMGCS2、HMGR。2.GP73在内质网应激 SCAP/SREBP1脂质代谢通路中发挥关键作用:我们用衣霉素(tunicamycin,Tm)、毒胡萝卜素(Thapsigargin,Tg)、H2O2、Cu SO4分别刺激细胞发生内质网应激,检测内质网应激对GP73表达的影响;最后利用RNAi技术将细胞内GP73敲低,再检测内质网应激发生后SCAP及SREBP1的表达,发现(1)药物刺激产生的内质网应激对GP73的表达有促进作用;(2)内质网应激对SCAP及SREBP1的表达具有促进作用;(3)在GP73敲低细胞内,利用药物激活内质网应激后,SCAP、SREBP1表达增加不显著。3.体内实验验证GP73对于内质网应激通路的影响:用药物Tm以2mg/kg小鼠的用量进行腹腔注射,作为内质网应激动物模型,0、8、12、24h后,取小鼠血清及肝脏组织,检测各项指标的变化情况。同时利用RNAi技术构建GP73敲低小鼠,将小鼠分为实验组及对照组,重复上述实验。结果发现(1)肝脏中GP73同C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)表达水平变化一致,随着药物作用时间的延长肝脏中GP73同CHOP m RNA逐渐升高,24 h时表达最高;(2)药物注射后随着刺激时间的延长,血清中胆固醇(CH)、甘油三酯(TG)的含量逐渐降低,而肝脏中CH和TG的水平基本呈增高趋势;(3)药物Tm刺激后小鼠肝脏中的GP73蓄积增加;(4)在药物Tm注射12 h后,肝脏组织中GP73m RNA水平表达明显增多,且胆固醇、甘油三酯及脂蛋白的水平急剧下降,然而在GP73敲低后可以缓解肝脏中脂质的下降水平;小鼠血液中胆固醇、甘油三酯及脂蛋白的水平明显升高,在GP73敲低小鼠中这种趋势则被抑制;(5)GP73敲低的小鼠肝脏中,脂质累积明显少于对照组。通过以上研究,我们首次发现了GP73通过参与内质网应激通路,调节了脂质代谢,并在固醇调节通路中扮演着重要作用。我们的研究证明GP73很有可能就是调控内质网应激诱发脂质代谢紊乱的关键分子。
【关键词】：GP73 内质网应激 脂质代谢 SCAP SREBPs
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R363
【目录】：

• 缩略词5-6
• 中文摘要6-8
• Abstract8-11
• 1 引言11-16
• 1.1 GP73、内质网应激及SREBPs的生物学特性11-13
• 1.2 GP73可能参与内质网应激通路导致肝脏疾病13-14
• 1.3 研究设想、实验方法和实际设计14-15
• 1.4 拟解决的问题、理论意义和实用价值等15-16
• 2 材料与方法16-24
• 2.1 菌株、细胞株及质粒16
• 2.2 分子生物学工具酶及试剂盒16
• 2.3 载体构建（阴影为酶切位点）16
• 2.4 细胞培养16-17
• 2.5 细胞转染17-18
• 2.6 免疫沉淀18
• 2.7 免疫印迹18-19
• 2.8 酶联免疫吸附（GP73 ELISA）19
• 2.9 细胞中总RNA的提取及RT PCR、合成c NDA19-22
• 2.10 免疫荧光（IF）22
• 2.11 蛋白相互作用试剂olink试验(PLA)22-23
• 2.12 小鼠体内GP73敲低的模型23
• 2.13 小鼠体内脂质含量的测定23
• 2.14 免疫组化及Oil Red O染色23-24
• 2.15 统计学分析24
• 3 结果24-41
• 3.1 GP73通过SCAP/SREBPs造成脂代谢异常24-30
• 3.2 GP73为内质网应激通路中的关键分子30-33
• 3.3 体内实验中内质网应激仍可通过GP73引起脂类代谢异常33-41
• 4 讨论41-44
• 4.1 GP73与肝癌发生的相关性41
• 4.2 内质网应激-GP73-SCAP/SREBPs-脂质代谢紊乱的分子机制解析41-44
• 5 结论44-45
• 6 参考文献45-48
• 7 附录48-49
• 8 致谢49-51
• 9 综述51-62
• 参考文献56-62

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