骨桥蛋白对间充质干细胞运动能力及其核力学性质的影响

发布时间：2017-09-10 21:08

  本文关键词：骨桥蛋白对间充质干细胞运动能力及其核力学性质的影响

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【摘要】：间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是一种中胚层来源的成体干细胞,在适宜的条件下可分化为神经细胞、肌肉细胞、成骨细胞以及成脂肪细胞等中胚层或其他非中胚层来源的细胞。MSCs分布广泛,在骨髓、牙髓、脂肪、外周血中都能够分离出来。在组织损伤修复中,损伤部位可分泌一些趋化因子,诱导MSCs定向迁移到损伤部位,并通过增殖、分化、分泌抗炎因子等方式促进组织修复。因为MSCs具有来源广泛、易于培养、免疫原性较弱、具有分化潜能以及不涉及伦理道德问题等特点,因此具有巨大的临床运用前景,其在组织损伤修复上的作用及机理已成为近年来的研究热点。骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)是一种广泛存在的基质蛋白和细胞因子,在干细胞壁龛(Niche)的维持、细胞的迁移与侵袭、癌细胞干性的维持、癌细胞凋亡的抑制及干细胞归巢等生理过程起非常关键的作用。研究表明,MSCs可响应损伤部位分泌的OPN发生定向运动,因此研究OPN影响MSCs运动能力的规律及其机理有助于揭示MSCs参与组织损伤修复的调控机制。细胞的运动在胚胎发生、伤口愈合、癌细胞的转移等生理过程中起关键的作用,其与细胞骨架重构、细胞-基质粘附、细胞以及细胞核力学性质有关,其中细胞核的硬度、变形性等力学性质决定了3D模型中细胞运动速度和效率。细胞的侵袭是依赖基质纤维水解的运动方式,其中有基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinases,MMPs)的参与。包括OPN在内的多种生化因子可通过一定的信号通路影响MMPs的表达,从而影响细胞的侵袭。尽管细胞迁移和侵袭的机制以及作用的理论比较透彻,但这方面的实验研究主要集中在癌细胞上,目前对MSCs的运动能力相关机理的研究还不是十分充分。鉴于MSCs运动能力和OPN存在广泛联系,且MSCs具有巨大的干细胞医疗运用前景,本文从信号转导和细胞核力学特征两方面探讨OPN影响MSCs运动能力的机制,以期为推动MSCs的临床应用提供研究数据参考。本文主要研究内容和结果如下:1.MSCs的分离、培养和鉴定本文采用差时贴壁法分离培养大鼠MSCs。结果发现,所得的细胞个体形状大致呈长梭形,折光率高;群体形态呈漩涡形。采用流式细胞术分析表面抗原表达情况,结果表明,培养分离的细胞表达CD90、CD44,而不表达CD34。细胞形态学观察和流式细胞术分析检测结果提示,所得的细胞符合间充质干细胞的一般特征。2.OPN对MSCs运动能力的影响本文采用transwell小室法检测OPN对MSCs运动能力的影响,结果发现,OPN作用下MSCs没有明显的增殖现象,但是其迁移和基质胶侵袭能力却显著加强,提示OPN可以增强MSCs的运动能力。Western blot检测结果显示,OPN处理能够有效提高FAK和ERK1/2分子的磷酸化水平,而FAK抑制剂PF573228或ERK1/2抑制剂PD98059处理均能有效下调OPN诱导的细胞迁移和侵袭,提示OPN通过激活FAK和ERK1/2促进MSCs的迁移和侵袭。使用明胶酶谱实验检测MMPs活力发现,OPN可显著增强MMP2活性,但对MMP9的活力没有显著影响;另外,PD98059和PF573228处理能下调OPN诱导的MMP2活性,提示OPN可能通过FAK、ERK1/2影响MMP2的活性,进而影响MSCs的侵袭。3.OPN对MSCs细胞核力学特征的影响为了验证细胞核力学特征变化在OPN诱导的细胞运动能力中是否有作用,本文使用原子力显微镜(Atomic force microscope,AFM)检测细胞核硬度变化,结果表明,OPN处理能够有效地降低MSCs细胞核的杨氏模量。使用PD98059或PF573228处理MSCs能显著恢复OPN诱导的细胞核硬度降低,提示FAK和ERK1/2介导了OPN对细胞核硬度的调节。细胞核骨架蛋白LaminA/C是影响细胞核硬度的主要因素。使用RT-PCR和Western blot检测OPN对laminA/C蛋白表达的影响,结果表明OPN的处理无论在mRNA水平上还是在蛋白质水平上都能显著降低LaminA/C的表达。进一步使用PD98059或PF573228处理细胞以阻断ERK1/2或FAK的磷酸化激活发现,两者均能够增加OPN降低的LaminA/C表达。这些实验结果表明,OPN通过FAK和ERK1/2降低LaminA/C表达,而LaminA/C的下调有可能是细胞核杨氏模量变化的原因。综上所述,本文研究结果表明,OPN通过FAK、ERK1/2影响MSCs的迁移,通过FAK、ERK1/2和MMP2影响MSCs的侵袭,并且OPN可能通过FAK、ERK1/2降低LaminA/C表达,降低MSCs细胞核硬度,从而提高MSCs的运动能力。
【关键词】：间充质干细胞 骨桥蛋白 细胞运动 细胞核硬度 核纤层蛋白A/C
【学位授予单位】：重庆大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 中文摘要3-5
• 英文摘要5-11
• 1 绪论11-18
• 1.1 研究背景11-16
• 1.1.1 骨桥蛋白的结构和功能11-12
• 1.1.2 OPN的受体12-13
• 1.1.3 MSCs和组织损伤修复的关系13-14
• 1.1.4 OPN与细胞运动能力14-15
• 1.1.5 细胞运动和细胞核的关系15-16
• 1.2 本文所关心的内容16
• 1.3 研究内容及其意义16-17
• 1.3.1 研究内容16
• 1.3.2 研究意义16-17
• 1.4 技术路线17-18
• 2 MSCs的分离、鉴定和培养18-23
• 2.1 引言18
• 2.2 实验材料18-19
• 2.2.1 主要仪器耗材18
• 2.2.2 实验试剂与药品18-19
• 2.2.3 实验动物19
• 2.2.4 主要实验试剂的配制19
• 2.3 实验方法19-20
• 2.3.1 MSCs原代分离和培养19
• 2.3.2 MSCs传代培养19
• 2.3.3 MSCs表面抗原分析19-20
• 2.4 实验结果20-21
• 2.4.1 MSCs的形态学观察20-21
• 2.4.2 MSCs表面抗原表达情况21
• 2.5 讨论21-22
• 2.6 本章小结22-23
• 3 OPN通过FAK、ERK1/2 提高MSCs的运动能力23-38
• 3.1 引言23
• 3.2 实验材料23-27
• 3.2.1 仪器耗材23-24
• 3.2.2 药品与试剂24-25
• 3.2.3 主要试剂配制25-27
• 3.3 实验方法27-30
• 3.3.1 细胞计数法检测细胞增殖27
• 3.3.2 Transwell小室检测MSCs的迁移和侵袭27-28
• 3.3.3 明胶酶谱法检测MSCs MMP2和MMP9的活性28-29
• 3.3.4 Western blot29-30
• 3.4 实验结果30-35
• 3.4.1 OPN处理不影响MSCs的增殖30-31
• 3.4.2 OPN促进MSCs迁移和侵袭31-32
• 3.4.3 OPN促进MSCs中FAK、ERK1/2 的磷酸化32-33
• 3.4.4 FAK、ERK1/2 磷酸化介导OPN诱导的MSCs迁移和侵袭33-34
• 3.4.5 OPN通过FAK、ERK1/2 影响MMP2活力34-35
• 3.5 讨论35-37
• 3.6 本章小结37-38
• 4 OPN通过FAK、ERK1/2 影响MSCs细胞核力学性质38-48
• 4.1 引言38
• 4.2 实验材料38-40
• 4.2.1 主要仪器与耗材38-39
• 4.2.2 主要实验药品与试剂39
• 4.2.3 主要试剂配制39-40
• 4.3 实验方法40-43
• 4.3.1 原子力显微镜检测细胞核硬度变化40-41
• 4.3.2 RT-PCR41-42
• 4.3.3 Western blot42-43
• 4.4 实验结果43-46
• 4.4.1 OPN通过FAK、ERK1/2 影响细胞核杨氏模量43-44
• 4.4.2 OPN影响MSCs LaminA/C表达44-45
• 4.4.3 FAK、ERK1/2 介导OPN对细胞核LaminA/C的下调作用45-46
• 4.5 讨论46-47
• 4.6 本章小结47-48
• 5 结论与展望48-49
• 5.1 主要结论48
• 5.2 后续研究工作的展望48-49
• 致谢49-50
• 参考文献50-57
• 附录A. 作者在攻读学位期间发表的论文目录57

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