人端粒酶逆转录酶基因shRNA慢病毒表达载体的构建及其病毒包装鉴定

发布时间：2017-10-01 02:32

  本文关键词：人端粒酶逆转录酶基因shRNA慢病毒表达载体的构建及其病毒包装鉴定

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【摘要】：目的:构建携带人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)慢病毒表达载体LV3-shRNA-hTERT及其病毒包装鉴定并稳定转染宫颈癌Caski细胞系。方法:使用Designer3.0(Genepharma)软件设计靶向hTERT的小发卡RNA(shRNA)序列,将hTERT-shRNA基因片段插入慢病毒载体pGLV3/H1/GFP+Puro中,构建慢病毒表达质粒LV3-shRNA-hTERT。通过酶切、DNA测序验证hTERT片段的准确性,将LV3-shRNA-hTERT与包装质粒共转染293T细胞,浓缩上清并测定病毒滴度获得重组慢病毒,将该重组慢病毒感染Caski细胞,通过观测绿色荧光蛋白(GFP)的表达判断转染成功与否以及估计转染效率,RTPCR、Western blot分别测定转染后不同时间点的hTERTmRNA水平和hTERT蛋白表达情况,TRAP-ELISA法测定细胞端粒酶活性。结果:LV3-shRNA-hTERT携带正确hTERT基因,重组病毒经PCR证实hTERT-shRNA基因插入。利用重组慢病毒介导将重组质粒LV3-shRNA-hTERT高效转导入宫颈癌Caski细胞并稳定表达,荧光显微镜观察转染后24 h Caski细胞即开始发出绿色荧光,72 h后有大量荧光表达,而在稳定转染空质粒的Caski细胞中不表达。检测转染后的Caski细胞,发现有3条链能明显抑制hTERT mRNA和蛋白水平的表达,并显著降低了细胞端粒酶活性,其中以72H-TERT-1515抑制作用最强,对hTERTmRNA和蛋白的抑制率分别达75.0%和70.3%,端粒酶活性下降74.6%。结论:成功构建携带hTERT-shRNA慢病毒表达载体LV3-shRNA-hTERT,并稳定转染Caski细胞系,实验设计的shRNA能有效抑制宫颈癌Caski细胞hTERT mRNA水平和hTERT蛋白表达,并显著降低细胞端粒酶活性。为端粒酶在宫颈癌发病机制的研究、宫颈癌基因治疗的体外干扰治疗奠定了工作基础。
【作者单位】： 广西医科大学第一附属医院妇产科;广西医科大学第一附属医院病理科;广西壮族自治区肿瘤防治研究所;
【关键词】： 宫颈癌 人端粒酶逆转录酶基因 小发卡RNA 慢病毒载体 Caski细胞
【基金】：广西自然科学基金项目〔2013GXNSFAA019254〕 广西壮族自治区卫生厅自筹经费科研课题〔Z2013013〕 广西研究生教育创新计划资助项目〔YCBZ2013015〕
【分类号】：R393
【正文快照】： 宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一,是女性生殖系统第二大肿瘤。虽然宫颈癌的发病机制尚未完全明确,但目前已获得公认的是高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)感染是发生宫颈癌的必要因素。宿主细胞感染后,HR-HPV E6蛋白能诱发端粒改变及端粒酶激活,而端粒酶异常表达可使细胞逃避衰老、

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本文编号：951858