磷酸盐耗竭反应系统对绿脓杆菌群体感应的影响及相应转录调控因子研究

发布时间：2017-10-08 11:12

  本文关键词：磷酸盐耗竭反应系统对绿脓杆菌群体感应的影响及相应转录调控因子研究

  更多相关文章： 绿脓杆菌 调控因子 群体感应 调控机理 磷酸耗竭逆境

【摘要】：绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa),属假单胞菌属(Pseudomonas),广泛存在于水、空气、土壤及动物和人的皮肤、消化道、呼吸道、尿道和肠道中,是一种条件致病菌,在特定的合适条件下能引起人和动物的感染发病。绿脓杆菌目前已成为危害人类健康及养殖业发展的重要疫病,其生物毒性主要是通过级联式的群体感应系统Quorum sensing system,QS)介导的。群体感应系统是一个依赖于细菌细胞数量的基因调控系统,在绿脓杆菌中分别表现为las、rhl以及pqs系统,其中las系统位于级联反应的顶端。低磷酸盐离子浓度条件下的绿脓杆菌,利用IQS系统,在低磷响应的转录激活因子Pho B的调控下,越过las系统,激活rhl以及pqs系统,表现生物毒性。在临床上,磷酸耗竭(phosphate depletion)是外科手术病人常见状况,此逆境条件常常导致包括绿脓杆菌引起的多种细菌病害的加重加剧,甚至导致死亡。我们通过HPLC和LC-MS的方法,分析高磷和低磷培养条件下的生物发酵液中信号变化趋势,进一步确定了环境中无机磷酸盐离子对绿脓杆菌群体感应系统的影响。为进一步阐明IQS调控机理及信号通路,我们利用转录组高通量测序的手段,确定了两个转录调控基因PA3045和PA2665。PA3045在HP-Las R和HP-PAO1比对,表达量显著的下调,下调倍数2.02,是双组分系统中的效应器,对应的感受器是PA3044;PA2665在LP-Pho B与HP-PhoB比对,表达量显著的上调,上调倍数2.07,是一种厌氧一氧化氮还原酶的转录调控因子。PA2665位于黄素血红蛋白基因上游,能调控其启动子中感受NO变化区域,从而调控黄素血红蛋白基因表达。对双组分系统PA3044、PA3045以及PA2665进行基因敲除和互补试验,发现PA3044对群体感应基因调控无显著影响。PA3045、PA2665敲除,对比野生型,生物膜产量增强,弹性蛋白酶产量增加,AHL信号产量增强,绿脓菌素产量也有一定程度增加,在运动性方面,swimming无影响,swarming相较于野生型增强,半径增大。这表明PA3045、PA2665均为负调控因子,能够影响绿脓杆菌诸多毒力因子表达,如生物膜、弹性蛋白酶、运动性等。由于日渐增多的抗菌药物的使用,病菌多重耐药、菌群失调等多种负面应用不断产生,细菌对抗菌药物耐药性的迅速增加已严重威胁到人类健康,多重耐药菌株的出现显著增加了患者的病死率和医疗费用,影响医疗质量。绿脓杆菌中的多种毒力因子表达及生物膜的形成都受到群体感应系统调控,研究绿脓杆菌群体感应系统,探明调控机理。通过干扰群体感应信号通路,使病原菌无法对抗宿主免疫防御系统,易于被宿主机体自身清除。这为研制新的治疗绿脓杆菌感染药物带来新的思路。本文从DNA水平验证PA3045、PA2665调控作用,为进一步找寻其信号通路,完善绿脓杆菌群体感应通讯系统打下基础。
【关键词】：绿脓杆菌 调控因子 群体感应 调控机理 磷酸耗竭逆境
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R378
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 1 前言10-21
• 1.1 绿脓杆菌概况10-13
• 1.1.1 绿脓杆菌危害10
• 1.1.2 绿脓杆菌的致病机理10-11
• 1.1.3 绿脓杆菌的耐药机理11-13
• 1.2 群体感应的发现及研究进展13-17
• 1.2.1 群体感应信号分子14-15
• 1.2.2 绿脓杆菌中群体感应的发现及研究进展15-17
• 1.3 本论文研究内容、目的及意义17-21
• 2 化学定性分析磷酸盐对绿脓杆菌的影响21-24
• 2.1 实验材料与方法21
• 2.1.1 菌株及培养基21
• 2.1.2 主要试剂及仪器21
• 2.1.3 发酵条件及发酵液的萃取、馏分的收集21
• 2.1.4 HPLC定性分析条件21
• 2.2 结果与分析21-23
• 2.2.1 HPLC结果分析21-23
• 2.3 讨论与结论23-24
• 3 转录组测序分析磷酸盐对绿脓杆菌的影响24-37
• 3.1 材料与方法24-27
• 3.1.1 菌株与培养条件24
• 3.1.2 细菌总RNA的提取24-25
• 3.1.3 细菌RNA质量检测25
• 3.1.4 文库构建和RNA-Seq测序25-26
• 3.1.5 RNA-Seq信息学分析26-27
• 3.1.6 转录组功能预测27
• 3.2 结果与分析27-36
• 3.2.1 细菌RNA的提取27-28
• 3.2.2 RNA检测结果28
• 3.2.3 转录组测序结果28-29
• 3.2.4 GO功能注释29-35
• 3.2.5 转录调控因子筛选35-36
• 3.3 结论与讨论36-37
• 4 绿脓杆菌转录组结果中差异显著基因的敲除与功能分析37-58
• 4.1 材料与方法37-46
• 4.1.1 菌株、质粒与引物37-38
• 4.1.2 主要试剂与仪器38-39
• 4.1.3 培养基、菌株培养条件及抗生素使用浓度39
• 4.1.4 PAO1基因组DNA的提取39-40
• 4.1.5 敲除载体pK18和互补载体pUCP18的质粒提取40-41
• 4.1.6 E.coli DH5α 感受态细胞的制备41
• 4.1.7 基因缺失突变体的获得41-46
• 4.1.8 互补体的获得46
• 4.2 突变体与互补体的表型测定46-47
• 4.2.1 运动性检测——swimming、swarming46
• 4.2.2 生物膜检测46
• 4.2.3 弹性蛋白酶检测46-47
• 4.2.4 AHL信号检测47
• 4.2.5 绿脓菌素检测47
• 4.3 结果与分析47-56
• 4.3.1 基因缺失突变体的构建47-49
• 4.3.2 突变体的表型结果分析49-56
• 4.4 结论与讨论56-58
• 5 总结论、创新点及进一步研究设想58-60
• 5.1 总结论58
• 5.2 创新点58-59
• 5.3 进一步研究设想59-60
• 致谢60-61
• 参考文献61-67

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 王诗琪;何晓静;李晓冰;菅凌燕;;铜绿假单胞菌群体感应系统研究进展[J];中国医院药学杂志;2016年02期

2 张健;林一民;;生物被膜的抗菌药物耐药机制及研究进展[J];检验医学与临床;2015年24期

3 葛静慧;崔玉娜;王晶;张公亮;孙黎明;侯红漫;;即食海参优势腐败菌群体感应信号分子识别[J];中国食品学报;2015年11期

4 潘婷婷;李镛;刘嘉琳;瞿洪平;;铜绿假单胞菌感应系统基因表达与毒力因子的相关性分析[J];内科理论与实践;2015年04期

5 陈越;孙景勇;倪语星;孙自镛;陈中举;胡志东;李金;徐英春;张小江;汪复;朱德妹;胡付品;蒋晓飞;胡云建;艾效曼;卓超;苏丹虹;褚云卓;田素飞;徐元宏;沈继录;张朝霞;季萍;俞云松;林洁;魏莲花;吴玲;张泓;孔菁;单斌;杜艳;王传清;王爱敏;;2012年中国CHINET铜绿假单胞菌耐药性监测[J];中国感染与化疗杂志;2015年03期

6 张青梅;孙福华;黄健城;范卫;;细菌群体感应调控系统及其信号干扰研究进展[J];上海畜牧兽医通讯;2014年06期

7 张燕飞;庞欢瑛;吴灶和;简纪常;鲁义善;;溶藻弧菌双组分调控系统PhoR/PhoB的基因克隆及生物信息学分析[J];广东海洋大学学报;2014年06期

8 曾莉莉;史道华;牛培广;;铜绿假单胞菌群体感应系统及其抑制剂的研究进展[J];中国抗生素杂志;2014年09期

9 许玉彬;张颖;王淼;王少伟;王刚;;细菌群体感应研究进展[J];河南农业科学;2013年12期

10 陈树林;黄彬;;铜绿假单胞菌群体感应系统的研究进展[J];中国微生态学杂志;2012年12期

，

本文编号：993688