Purα基因过表达和RNAi慢病毒载体的构建及应用

发布时间：2017-10-08 22:31

  本文关键词：Purα基因过表达和RNAi慢病毒载体的构建及应用

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【摘要】：目的构建Purα基因过表达以及SiRNA慢病毒表达载体,通过包装病毒,以用于神经系统细胞感染及原代培养神经元的基因操作。方法 1)过表达载体的构建:本实验使用pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP和pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP慢病毒载体,PCR扩增Purα全长基因,然后亚克隆到pCDH载体相应的多克隆位点之中,进行酶切和测序鉴定;2)ShRNA慢病毒表达载体的构建:根据shRNA的特征,设计shRNA的DNA序列以及其反向互补序列,然后合成并克隆到慢病毒载体pLKO.1-puro的相应位点中。3)慢病毒包装和滴度测定:将克隆好的pCDH-Purα和pLKO.1-puro-shRNA载体和病毒包装质粒pCMV-VSVG、pCMV-dR8.2 dvpr按相应的比例转染到293FT细胞中,48h后收集上清液,纯化、浓缩,进行滴度测定。结果测序结果证实所插入片段相位正确,转染后通过RT-PCR和Western blot证实过表达组Purα基因表达增高,而沉寂组的Purα表达抑制,达到实验设计要求,可以用于实验研究。结论利用本方法可以快速地进行目的基因的基因操作,省时、节约,与同类型的方法比较,具有较大的优越性,可以在实验中推广应用。
【作者单位】： 宁夏医科大学基础医学院;宁夏医科大学宁夏颅脑疾病重点实验室;
【关键词】： Purα 慢病毒表达载体 RNA沉寂 基因过表达 基因操作
【基金】：国家自然科学基金(81260197) 973基金(2012CB722408)
【分类号】：R346
【正文快照】： 在基因分析过程中对目的基因进行敲除是一种行之有效的方法,但是在实际操作过程中存在着周期长、费用高的问题,而且有些目的基因的系统性敲除会造成子代动物死亡于胚胎期或在出生后即死亡的问题,并不能达到基因分析的目的[1]。RNAi技术的出现为解决这一难题提供了有效的途径,

【共引文献】

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