RHCE基因编码区测序技术及血源性疟疾检测的新方法

发布时间：2017-10-28 04:21

  本文关键词：RHCE基因编码区测序技术及血源性疟疾检测的新方法

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【摘要】：PART IRHCE基因编码区测序技术背景：Rh血型系统包括50多个抗原,与临床密切相关的抗原主要有D、C、c、E和e等抗原。Rh血型系统中除D抗原具有很强的免疫原性外,RhC,c,E和e抗原可导致新生儿溶血病(hemolytic disease of fetal and newborn,HDFN)和迟发性溶血性输血反应(delayed hemolytic transfusion reaction,DHTR).长期异体输血产生的不规则抗体所引起的输血反应日趋受到关注,其中又以Rh血型系统的相关抗体(抗-E抗-C抗-e抗-c)所引起的输血反应最为常见和具有临床意义,Rh血型不相合的血液的长期输注将严重影响临床输血的安全性与有效性。正确的定型是配型输血的前提。目前临床血型定型的主要方法仍然是血清学方法,而血清学方法在实际应用过程中由于存在多种细胞群或嵌合现象,如长期定期输血后、造血干细胞移植后、输注ABO血型不符血液后等引起的混合凝集；直抗阳性个体,由于高效价自身抗体的存在,使自身抗体可以在体外与所有红细胞发生强烈的抗原抗体反应；弱表达抗原,由于膜抗原分子数或抗原位点数减少,使得抗原抗体反应或血清学检测结果减弱,常常被鉴定为阴性；以及其他一些临床面临的困难如红细胞标本量不足或缺少等。PCR技术的发展对血型分子水平的研究具有划时代的意义。目前国内外最常用的PCR基因定型技术是序列特异性引物PCR技术(sequence specificprimer-Polymerase Chain Reaction,PCR-SSP), PCR-SSP作为一种特异性的基因序列多态性分析技术,其基本原理是根据碱基序列的差异设计序列特异性引物,这对引物仅能与目的序列的完全互补配对,扩增出目的序列,再根据扩增产物的有无进行定型。价格低廉、应用简便和特异性强使得PCR-SSP技术在血型鉴定领域得到快速发展,目前市场上已有许多成熟的血型基因定型试剂盒。RHCE基因定型的依据是RhC/c及RhE/e抗原多态性的分子机制,即RhC/c是由于RHCE基因第1、2外显子发生了6个碱基置换(分别是48GC、150C、178C A、201AG、203AG和307CT)并导致4个氨基酸的替换(分别是第16位Cys→Trp、60位ILe→Leu、68位Ser→Asn和103位Ser→Pro),涉及第2个胞外环；RhE/e抗原是由于第5外显子1个碱基置换(C→G)导致了1个氨基酸的替换(第226位Pro→la),涉及第4个胞外环。PCR-SSP技术应用于RHCE基因分型的缺点也很明显,1)PCR-SSP方法存在一定比例的假阳性或假阴性结果,RHC等位基因的检测会因RHc在第1外显子第48位点的突变干扰而导致假阳性结果,且会因109 bp插入序列的缺失而导致假阴性结果,RHc等位基因的检测会因RHCE基因第2外显子的第178、201、203和(或)307位点碱基突变的而影响定型结果。2)RHCE等位基因的多态性对PCR-SSP的影响,研究表明目前观察到的RHCE等位基因已超过70个,但PCR-SSP技术很难同时用于检测所有的RHCE等位基因,尤其是低频抗原的基因型。3)复杂遗传因素对PCR-SSP的影响,不同民族和不同人群的RH基因有着不同的遗传背景。同时,高加索人存在更多的RHD和RHCE基因稀有变异型,这其中不仅包括各种碱基替代、插入和缺失,还包括更为复杂的RHCE/RHD基因交换。这些复杂的变异导致PCR-SSP常常在基因定型中出现假阴性和(或)假阳性,甚至无法定型。随着测序方法尤其是二代测序的发展,测序越来越来简便快速且越来越廉价,测序逐渐成为继PCR-SSP技术后又一大新的基因定型和序列分析技术,以往文献报道多是针对RHCE基因的某个或某几个外显子进行序列分析,不利于观察整个RHCE基因编码区,为此本文设计一种简易的RHCE基因编码区全长测序方法,并用于长期输血患者、疑难血型样本、RHCE基因变异个体及家系的研究,以及RhCcEe血型配型输血。目的：本研究旨在一种简易的RHCE基因编码区全长测序方法,方便临床实验室使用的RHCE基因定型方法。方法：1.研究对象和材料实验样本来源于深圳市血液中心采集的400份随机的无偿献血者样本,来源于陕西省血液中心的1个D--个体样本,1例来源于深圳市血液中心Rh阴性样本,以及1例弱E样本来自辽宁省血液中心(以下简称为弱E样本)。上述所有实验样本均经过血液中心法定检测项目的合格血液。2.实验方法(1)血清学检测：采用抗-RhC、抗-Rhc、抗-RhE和抗-Rhe血清检测样本红细胞表面RhCcEe抗原表型。(2)PCR-SSP基因定型：利用RHCE基因与RHD基因的序列的差异以及RHCE等位基因多态性特点,设计RHC、RHc、RHE和RHe四个扩增体系,根据相应体系内扩增产物的有无来定型。(3)测序：依据RHCE基因序列的特异性,设计10对特异性引物分别扩增RHCE基因的10个外显了,扩增产物先经过电泳确认,然后再对扩增产物进行纯化,测序,最后对测序得到的基因序列进行比对分析。结果：1.400名无偿献血者样本血清学定型结果显示包含9种表型,并从400名无偿献血者样本中筛选得到弱表达的样本7例。2. PCR-SSP方法得到400例无偿献血者样本(包括7例弱表达样本)的基因型均与血清学相符；D--个体定型结果显示：RHCE基因型是DC-,与血清学定型结果(D--)不符。阴性样本基因定型结果(dccee)亦与血清学结果相符。3.测序结果显示：400例无偿献血者样本中399例(包括6例弱表达样本,分别是4例弱e、1例弱c和E及1例弱E)的RHCE基因外显子序列与正常RHCE基因序列没有差异,1例表型Ccee(弱c)的样本的第7外显子存在一处变异,即1059GA (Genbank注册号：KT957625),该突变导致氨基酸W353*替换。D--个体测序结果：PCR扩增和测序结果显示缺失第3、4和第5外显子,其他外显子测序结果未发现变异。PCR-SSP定型结果显示RHC阳性(DC-)。弱E样本观察到第5外显子存在一处突变(762GC),综上,D--测序结果提示该个体携带一种新的由RHCEIRHD基因交换形成的等位基因RHCE-D(3-5)-CE.结论：1. RHCE基因编码区全长测序方法能在统一的反应条件下成功特异性扩增RHCE基因的10个外显子；2. RHCE基因编码区全长测序方法可用于一般实验室进行RHCE基因测序并能解决临床中的疑难定型的样本；3. RHCE基因编码区全长测序方法对于长期定期输血患者以及疑难定型样本的准确定型及配型输血具有重要意义,正确的定型是安全输血的前提,也是减少同种异体抗体产生的重要手段。PART Ⅱ血源性疟疾检测的新方法背景：我国目前疟疾发病人数呈逐年下降趋势,但随着我国与东南亚、非洲、南美洲等疟疾高发区的经贸交流日益频繁,疟疾的防治形势依然严峻。据WHO发布的最新情况,2013年仍有共计约1.98亿疟疾患者,其中有58.4万人死亡[6]。白1911年Woolsey报道首例输血性疟疾后,世界各地均有输血性疟疾的报道。输血作为各种疾病治疗措施的应用逐年增多,加之在献血员的筛选试验中,很多国家还没有把疟疾的检测作为常规的必查项目,由输血引起的疟疾时有发生,不仅会加重患者病情,而且给临床输血安全带来了隐患。近年来,陆续在北京、广东、浙江、江苏、四川等地发现入境及归国人员感染疟疾的病例及死亡个例,使得我国输血性疟疾感染的风险逐渐升高。感染人类的疟原虫有5种,分别是恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫、卵型疟原虫和诺氏疟原虫,其中恶性疟最常见且致死率最高。疟原虫的雌、雄配子在按蚊虫体内结合发育完成后通过叮咬侵入人体,疟原虫早期寄生在肝细胞中,后期主要寄生在红细胞内。疟原虫在宿主红细胞内以血红蛋白中的珠蛋白部分为营养来源,而血红蛋白的血红素部分则释放出来成为游离血红素,为避免游离血红素对疟原虫自身的杀伤作用,疟原虫将游离血红素转化成不可溶的高铁血红素结晶,即疟色素。疟色素是在疟原虫食物泡内合成的,并随着疟原虫感染红细胞(Plasmodium infected red cell, iRBC)的破裂而释放到血浆中,其中大部分被吞噬细胞所吞噬。由此可见,疟疾患者的红细胞、血清和吞噬细胞中均存在疟色素。目前已有疟疾的检测方法主要可以分为三类,一是血涂片镜检,血涂片吉姆萨染色后光学显微镜下检测,以是否观察到红细胞内期疟原虫为判断的标准,此方法仍然是目前疟疾检测的“金标准”,其操作简便所需仪器少,但存在耗时长且对实验人员经验要求高等缺点,二是抗原抗体检测,以抗原抗体特异性结合的原理发展了许多种检测方法,如酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA),免疫胶体金,电化学发光等疟疾抗原抗体的检测方法,此类方法操作检测快捷,但存在一定程度的假阴性,且灵敏性较差,三是核酸检测,以PCR为代表的疟疾特异性核酸片段的检测,其灵敏性大大提高,但由于其所需实验条件较高而难以推广使用。拉曼光谱技术是一门涉及光学、物理学、材料学和计算机等学科的综合交叉技术,它的基本原理是：一束单色光入射介质后会出现透射、吸收、散射3种情况,散射光中的大部分波长与入射光相同,称为瑞利散射,而一小部分由于介质中分子振动和分子转动的作用使波长发生偏移,称为拉曼散射,通过分析拉曼光谱特征峰位置、强度和线宽提供分子振动、转动方面的信息,据此可以反映出分子中不同的化学键或官能团,因此拉曼光谱成为研究物质分子结构的有效手段。拉曼光谱技术具有以下两个优势,一是无损,拉曼光谱技术是一种无损伤检测的新技术,生命科学领域的研究对象主要有核酸、蛋白、糖类和脂类。拉曼激光的光子能量低,不会对其产生有损伤作用的电离,特别适用于细胞和组织的检测。拉曼光谱技术所需样品量非常少,样本无需进行染色或去除杂质等处理,液体固体均可,甚至活细胞原位也能进行检测,而且检测后对样本无影响,这可避免常规检测手段样本处理过程中待检物的损失和待检物理化性质的改变,二是光谱的特异性,每一种物质均具有拉曼光谱指纹特征,即特征峰,拉曼光谱对核酸、蛋白、糖类和脂类等的生物大分子构象特别敏感,能够探测到物质内构象的细微变化,这对分析生理和(或)病理状态下生物大分子的组成和结构差异具有优势。目的：本研究旨在建立高灵敏、高特异性的拉曼光谱检测平台,为疟疾检测提供一种新的准确、简便、敏感的方法。方法：1.研究对象和材料实验样品包括制备的p-血色素、体外培养恶性疟原虫感染红细胞、不同虫血率下(10%,5%,2.5%,1%,O.5%和0.01%)的疟色素提取物、正常未感染新鲜红细胞。2.实验方法(1)疟原虫培养：疟原虫虫株是恶性疟原虫3D7,采用37℃、5%CO2连续培养。(2) β-hematin合成与拉曼光谱检测：β-hematin的合成采用的是酸萃取法,将合成的β-hematin粉末均匀的涂抹在玻片上,检测仪器为显微共聚焦拉曼光谱仪。(3)疟色素的提取与拉曼光谱检测：疟色素的检测分为疟色素提取物检测和疟色素原位检测,疟色素的提取采用的是皂素溶液裂解宿主红细胞释放的方法。快速成像系统用于原位检测,显微共聚焦拉曼光谱仪用于疟色素提取物检测。(4)SERS在疟色素检测中的应用：两种不同材料的表面增强材料用于增强疟色素的拉曼信号。快速成像系统用于iRBC的拉曼成像。结果：1.获得了疟原虫感染后产生疟色素的特征拉曼光谱,疟色素与P-hematin(阳性对照)具有相似的特征峰,且两者的拉曼光谱峰稳定一致。2. iRBC和nRBC血涂片检测结果显示,拉曼光谱峰相对强度的变异系数小于20%,相对位移的变异系数小于1%,两者具有良好的一致性,即血涂片下显微拉曼光谱检测不能区分正常红细胞和疟原虫感染红细胞。3. 建立了iRBC的疟色素提取方法,疟色素与血红蛋白可实现有效的拉曼光谱鉴别,检测感染率可达O.1%。4.快速拉曼光谱成像仪扫描可疑iRBC和nRBC,得到的光谱以1372cm-1峰强作为拉曼成像的参照峰,做出的疟色素分布图与光镜下疟色素空间分布相同,即疟原虫红细胞原位扫描成像与光镜下的疟色素空间分布具有良好的一致性。结论：1.拉曼光谱技术能用于疟原虫的检测,能成功获得疟色素的特征峰,能成功鉴别疟疾感染红细胞和正常红细胞。2.疟色素提取浓缩物与β-血色素(阳性对照)的拉曼光谱具有良好一致性,与正常血红蛋白(阴性对照)存在明显差异,疟色素提取方法能使检测灵敏度达到0.1%的虫血率。3.感染疟原虫红细胞原位扫描能获得清晰的疟色素分布图且能鉴定食物泡和虫体,并可用于鉴定宿主红细胞内疟色素分布的位置以及检测相对含量。
【关键词】：基因序列分析D--弱抗原疟疾拉曼光谱
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R531.3
【目录】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-21
• 前言21-27
• PARTⅠ RHCE基因编码区测序技术27-47
• 1 材料27-28
• 1.1 样本27
• 1.2 主要试剂27
• 1.3 主要仪器27-28
• 1.4 主要溶液的配制28
• 1.5 引物合成28
• 2 方法28-34
• 2.1 Rh血型表型血清学分型28-29
• 2.2 RHCE基因型分型检测29-31
• 2.3 RHCE基因测序方法的建立31-34
• 3 结果34-44
• 3.1 血清学测定34-36
• 3.2 RHCE基因分型36-38
• 3.3 RHCE基因测序38-44
• 4 讨论44-46
• 5 小结46-47
• PARTⅡ 血源性疟疾检测的新方法47-67
• 1 材料47-48
• 1.1 研究样品47
• 1.2 主要试剂47
• 1.3 主要仪器47
• 1.4 主要溶液配制47-48
• 1.5 光谱处理48
• 2 方法48-52
• 2.1 疟原虫的培养及血涂片检测48-49
• 2.2 拉曼光谱仪参数调节及数据处理49-50
• 2.3 β-血色素的合成及拉曼光谱检测50
• 2.4 疟色素的拉曼光谱检测50-51
• 2.5 SERS及快速成像在疟疾检测中的应用51-52
• 3 结果52-63
• 3.1 疟原虫培养及拉曼检测52-53
• 3.2 β-血色素的拉曼光谱53-54
• 3.3 疟色素的拉曼光谱54-61
• 3.4 SERS及快速成像的应用效果61-63
• 4 讨论63-66
• 5 小结66-67
• 参考文献67-74
• 附录74-75
• 缩略词75-76
• 攻读学位期间成果76-77
• 致谢77-78

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