布鲁氏菌蛋白质文库的建立及感染与免疫鉴别诊断标识抗原的研究

发布时间：2018-07-04 23:30

  本文选题：布鲁氏菌 + 蛋白质文库　； 参考：《中国疾病预防控制中心》2013年硕士论文

【摘要】：布鲁氏菌病(Brucellosis,简称布病)是严重危害人体健康、畜牧业发展及社会经济发展的人畜共患性传染病,由布鲁氏菌(Brucella)感染引起。牛、羊等家畜是动物及人类布病的主要传染源；传播途径主要有消化道、呼吸道及皮肤黏膜等方式；人类、家畜等普遍易感。 目前,布病诊断的金标准仍是细菌分离培养,但分离率低、分离难度大,耗时长,且存在一定的生物安全问题,不适用于快速诊断和大量样本的处理。因此,国内临床上采用血清学检测方法虎红平板凝集试验(RBPT)和试管凝集试验(SAT)相结合的方法诊断布病。但RBPT法假阳性率高；而SAT法易与其它微生物发生交叉反应,操作繁琐,耗时长,且无法区别SAT阳性血清是由疫苗免疫还是自然感染引起。研究发现酶联免疫吸附实验(ELISA)与传统的SAT、补体结合实验(CFT)相比,有更高的敏感度和特异度。以光滑型脂多糖(S-LPS)做为抗原的ELISA已发展为成熟的商品化试剂盒用于牛布病的诊断。但由于S-LPS也可与耶尔森氏菌等发生交叉反应,所以本研究试图选用布鲁氏菌中抗原性较强且具有代表性的重组蛋白做为抗原进行间接酶联免疫吸附实验(iELISA),从而建立以重组蛋白做为抗原的iELISA方法,为研制快速诊断布病的iELISA试剂盒奠定基础。 由于自然患病牛主要感染牛种布鲁氏菌,而我国普遍应用于牛的疫苗是羊种(M5)和猪种(S2)布鲁氏菌的减毒活疫苗。运用蛋白omp31存在于除牛种之外的所有布鲁氏菌种的特性,建立以omp31为抗原的iELISA方法,可将牛种布鲁氏菌与非牛种布鲁氏菌区分开,进而鉴别SAT阳性的牛是由自然感染引起还是免疫接种引起。 目前,布鲁氏菌的蛋白研究涉及的种类较多,研究的角度和侧重点不同,信息较为庞杂。针对这一现状,本研究建立了布鲁氏菌蛋白质文库,梳理了部分布鲁氏菌主要蛋白的研究进展,并将其分为外膜蛋白(OMP)、Ⅳ型分泌系统(T4FF)蛋白、胞质结合蛋白和酶类及其他,就其免疫原性与抗原性、用于诊断方面的价值及致病机理等方面加以综述。并从蛋白质文库中选取了研究资料较少且在T4FF中有重要作用的蛋白virB8进行了克隆表达,成功纯化出重组蛋白virB8,并与本实验室保存的bp26和omp31两种蛋白一同进行了iELISA方法用于检测布病的研究。测得virB8、bp26及omp31的最佳包被浓度分别为12.90ug/ml,2.60ug/ml,1.24ug/ml;血清最佳稀释度均为1：100；二抗最佳稀释度均为1：20000。用70份北京大兴区牛场健康牛血清测得virB8、bp26及omp31三种抗原的cutoff值分别为：0.199,0.220,0.242。用RBPT与SAT结合检测河南100份牛血清,结果56份为布病阳性,44份阴性。以virB8做抗原检测判定为阳性的血清为14份,灵敏度为17.9%,特异度为90.9%,对于布病的检测没有实际的应用价值。以bp26做抗原的检测中,判定为阳性的血清共45份,其灵敏度为75%,特异度为93.2%；符合率为83%,Kappa值为0.664,说明两种检验方法中高度一致。对两种检测方法进行配对卡方检验,P值0.05,故认为差异有统计学意义,两种检测方法存在差异,SAT优于以bp26做抗原的iELISA方法。以omp31做抗原检测判定结果均为阴性,推定此次采集的河南牛血清中诊断为患病的牛均由自然感染引起。尽管bp26做为抗原的iELISA实验对诊断布病有一定的积极意义,但灵敏度仍不高,下一步将继续筛选布氏菌标识抗原,探索多种抗原联合诊断布病的iELISA方法。 本研究的结果为建立更加系统、全面、权威的布氏菌蛋白质文库奠定了基础；对筛选重组抗原应用于iELISA方法检测布病具有重要的意义,为研制多种重组抗原联合应用检测布病奠定了基础；同时为区分SAT阳性的牛是自然感染还是疫苗免疫提供了切实可行的方法,对畜牧业及经济的发展做出了贡献。
[Abstract]:Brucism is a zoonotic infectious disease which is seriously harmful to human health , animal husbandry development and socio - economic development , which is caused by infection of brucella . Domestic animals such as cattle and sheep are the main source of infection of animals and human diseases .
The main route of transmission is digestive tract , respiratory tract and mucous membrane of skin and so on .
human , livestock and so on .

At present , the gold standard for the diagnosis of cloth diseases is still bacterial separation and culture , but the separation rate is low , the separation is difficult , the time is long , and there is a certain biological safety problem , which does not apply to the rapid diagnosis and the treatment of a large number of samples .
In this study , it was found that ELISA was used as antigen for diagnosis of cattle disease . However , it was found that ELISA was used as antigen to diagnose bovine bu disease .

Because naturally diseased cattle are mainly infected with cattle , the vaccine of cattle is the attenuated live vaccine of sheep ( M5 ) and porcine race ( S2 ) . By using omp31 as antigen , the iELISA method is established , which can distinguish the bovine and non - bovine brucella , and then discriminate whether the SAT - positive cattle are caused by natural infection or vaccination .

In this paper , we reviewed the research progress of the major protein of brucella , and then divided it into outer membrane protein ( OMP ) , type 鈪，

本文编号：2097927