白细胞介素-21在慢性HBV感染者发生HBeAg血清学转换中的作用

发布时间：2018-10-12 11:03

【摘要】：背景：乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)感染是一个世界性公共卫生问题,调查显示目前全球约有4亿慢性HBV感染者,这些感染者具有潜在发展为肝硬化、肝癌等疾病的风险。慢性HBV感染自然史中,每年约有2-15%感染者能够自发发生HBeAg血清学转换,长期随访发现这些感染者往往成为稳定的非活动性HBsAg携带者(inactive carrier, IC),通过自身免疫应答能够有效控制病毒复制,抑制肝脏炎症,其发生肝硬化、肝癌的风险也远远低于HBeAg阳性的感染者。对于已经发生肝炎的慢性HBV感染者,目前国内外的慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)防治指南都指出：抗病毒治疗是CHB患者最重要的治疗手段,它能够有效控制肝脏炎症、阻止肝硬化的发生,进一步改善患者生活质量,提高生存率。乙肝病毒e抗原(HBeAg)阳性CHB患者进行抗病毒治疗,目前认为较为满意的治疗终点是控制肝脏炎症、抑制HBV DNA复制,并发生HBeAg血清学转换,即血清中HBeAg消失,同时出现能够识别HBeAg的T细胞依赖性中和抗体即e抗体。而能够发生HBeAg血清学转换的患者通常转换为非活动性HBsAg携带者。目前,导致HBeAg血清学转换的病毒因素和宿主免疫机制尚未完全阐明,并且抗病毒治疗中存在的一个重要问题：药物能够有效抑制病毒,控制肝脏炎症,但并非所有患者都能达到HBeAg血清学转换；一旦停止治疗,往往出现高病毒载量的反弹,以及肝脏炎症的复发。这一结果将使不能发生HBeAg血清学转换的CHB病人必须面对高昂的费用,以及长期用药的不便。白细胞介素-21(interleukin-21, IL-21)是I类细胞因子家族中的一员,其受体与IL-2、IL-4、IL-7、IL-9以及IL-15的受体共用Y链。IL-21主要由CD4+T细胞的众多亚群分泌,包括Th17细胞、滤泡辅助性T细胞(TFH),以及NK T细胞等。IL-21能够增强B细胞、T细胞以及NK细胞的免疫应答和调节功能,故认为其是连接天然免疫和适应性免疫的桥梁。由小鼠模型建立的慢性淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitis virus, LCMV)感染中,已证实IL-21能够促进功能耗竭的CD8+T细胞控制病毒,并且在有关人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)感染的研究中,IL-21与CD8+T细胞免疫应答相关。另外在转基因小鼠模型建立的急性HBV感染中,证实成年鼠能够清除HBV,且其肝脏内淋巴细胞分泌的IL-21显著性高于幼年鼠,而IL-21能够提升CD8+T细胞功能,促进B细胞分泌抗体,最终有效清除病毒。因目前并非所有使用抗病毒药物患者都能产生HBeAg血清学转换,且IL-21在人慢性HBV感染中的作用尚未见明确报道,鉴于IL-21能够增强T、B细胞免疫应答,本研究假设IL-21可能促进HBeAg血清学转换的发生和机体对HBV的控制。目的：通过对慢性HBV感染自然史的横向研究和HBeAg阳性CHB患者抗病毒治疗的动态观察,检测IL-21在血清蛋白水平、相关转录因子mRNA水平及外周血分泌细胞水平的表达情况,了解IL-21在慢性HBV感染中的变化规律,分析其与肝脏炎症和病毒复制的相关性,特别是其与]HBeAg血清学转换之间的关系,并通过体外实验探索IL-21在慢性HBV感染中的作用,期望为CHB的诊断及疗效预测寻找新的生物学标志和潜在的免疫治疗手段。方法： 1.研究对象横向研究共纳入119例受试者,其中包括免疫耐受期患者(immuno tolerant carrier, IT)20例,HBeAg阳性CHB患者58例,非活动性携带者(inactive carrier,IC)21例,并选取20例健康人(healthy controls, HC)作为研究对照,不同慢性HBV感染者诊断标准主要参考中国慢性乙型肝炎防治指南2010年更新版。 IT纳入标准为：在至少1年连续3次或以上随访中HBsAg阳性、HBeAgP日性,且血清ALT水平正常(1ULN)。IC纳入标准为：在间隔至少6个月的两次随访中,HBsAg阳性、HBeAg阴性、HBeAb阳性,血清ALT水平持续正常(1ULN),且HBV DNA定量10,000copies/mL。HBeAg阳性CHB患者纳入标准为,血清HBsAg、HBeAg阳性、抗-HBe阴性,HBV DNA100,000copies/mL,且过期血清ALT持续或反复升高(1ULN)。健康志愿者20人,来源于南方医院肝病中心实验室的工作人员或南方医科大学在校学生,纳入标准为：血清HBsAg阴性,且血清ALT水平正常(1ULN),无其他严重疾患。所有研究对象均排除以下情况：(1)正在接受或曾经接受过抗HBV治疗；(2)合并感染人类免疫缺陷病毒(HIV)、甲型肝炎病毒(HAV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)或戊型肝炎病毒(HEV)；或(3)合并甲状腺功能亢进、糖尿病等自身免疫性疾病；或(4)合并恶性肿瘤；或(5)合并其他严重代谢性疾病；或(6)影像学或组织学发现明显肝硬化。纵向研究纳入的研究对象来源于一项多中心开放性的替比夫定Ⅳ期临床试验(600mg/d, CLDT600ACN07T)中的75例HBeAg阳性CHB患者,其中48例来自广州南方医院,27例来自新疆医科大学附属第一医院。纳入标准包括丙氨酸氨基转移酶(ALT)高于正常上限(ULN), HBV DNA定量100,000copies/mL。所有研究对象于治疗基线、12周、24周以及52周采集1mL血清用于细胞因子检测,南方医院的纳入对象于以上4个时间点留取20mL肝素抗凝血用于免疫学实验。血清标本用干冰运输,保存于-80℃。根据治疗52周时是否发生HBeAg血清学转换,以及血清HBV DNA定量300copies/mL,将研究对象分为完全应答组(CR,n=14)和非完全应答组(NCR, n=61).另根据治疗52周HBV DNA定量是否低于300copies/mL,而不论HBeAg是否阳性,将研究对象分为病毒学应答组(VR,n=32)和非病毒学应答组(NVR,n=43)。为验证血清IL-21浓度与治疗应答之间的关系,我们的研究在另外103例CHB患者(CR,n=42; NCR, n=61)进行重复验证,这部分患者来源于另一项替比夫定抗病毒治疗的临床试验。分离血清保存于-80℃。所有研究符合赫尔辛基宣言,并经南方医院伦理委员会审核同意,所有研究对象签署知情同意书。 2.血清IL-21表达水平的测定应用酶联免疫吸附试验法检测受试者血清IL-21的表达水平,包括横向研究中119例患者,及75例HBeAg P日性CHB患者抗病毒治疗基线、12周、24周及52周4个时间点,及验证队列中103例CHB患者治疗基线、12周和24周共3个时间点的检测。 3.外周血IL-21分泌细胞及相关表面分子的检测利用流式细胞内因子染色技术检测外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)中分泌IL-21的细胞亚群的分布情况,横向研究比较不同慢性HBV感染者之间IL-21分泌细胞频数的差异,以及IL-21分泌细胞与其他重要细胞亚群(如Th1、Th2、Th17及TFH细胞)之间细胞因子共表达的情况。另外,观察CHB患者52周抗病毒治疗中IL-21分泌细胞频数的动态变化,以及与抑制性调节因子PD-1之间的相关关系。通过表型标记检测不同HBV感染者外周血中免疫细胞表达IL-21R的情况。 4.IL-21相关转录因子mRNA水平的表达通过分离PBMC,提取RNA,逆转录得到cDNA,采用实时荧光定量PCR方法检测横向研究中76例患者IL-21R mRNA水平的表达情况,另外同时检测17例IC与21例CHB患者IL-21相关转录因子Bcl-6和ROR-γT的表达情况。 5.IL-21在体外对T、B细胞免疫应答影响的研究通过非特异性刺激物和特异性HBcAg刺激,比较IC和CHB患者间外周血分泌IL-21的CD4+T淋巴细胞频数差异。利用磁珠分选技术,得到CHB患者CD8+T细胞和IC患者CD8-T细胞,在HBV特异性抗原的刺激下利用Transwell板共培养3天,利用流式检测CD8+T淋巴细胞表达IL-21R的情况。在HBV特异性抗原及rh IL-21共刺激培养PBMC10天后,分别检测IC和CHB患者PBMC培养上清中HBV特异性抗体的产生。结果： 1.慢性HBV感染者不同状态下IL-21的表达情况不同慢性HBV感染者间血清IL-21水平的表达慢性HBV感染不同状态下血清IL-21水平具有显著性差异(p0.0001)。IC组(p=0.011)和CHB组(p0.0001)血清IL-21水平显著性高于IT组,但两者间无统计学差异(p=0.260)。IT组血清IL-21水平高于HC组,但无统计学差异(p=0.265)。在ALT正常群体(IT和IC,n=41)血清IL-21水平显著性低于ALT异常组(n=58,p=0.003)。CHB组血清IL-21水平与血清ALT水平(r=0.156,p=0.180)或HBV DNA定量(p=0.230)之间并不存在相关关系。慢性HBV感染者的年龄与血清IL-21水平呈正相关关系(p=0.006,r=0.277)。不同慢性HBV感染者间分泌IL-21的CD4+T淋巴细胞频数比较通过流式细胞术检测发现CD4+T淋巴细胞是分泌IL-21的主要来源,CD8+T淋巴细胞、B细胞、NK细胞等其他细胞也能够分泌IL-21。佛波酯非特异性刺激6小时后,不同慢性HBV感染者PBMC中IL-21+CD4+T淋巴细胞频数存在显著性差异(p0.0001)。IC组IL-21+CD4+T淋巴细胞频数显著性高于IT组(p=0.020)和CHB组(p=0.001)。不同慢性HBV感染者间IL-21相关转录因子mRNA水平的表达慢性HBV感染不同组间IL-21R mRNA水平具显著性差异(p=0.007)。CHB组患者IL-21R mRNA水平显著性高于IT组(p=0.006),但与IC组间比较无统计学差异(p=0.150)。IT组患者PBMC的IL-21R mRNA水平显著性低于HC组(p=0.001)。进一步分析IL-21两个重要来源细胞TFH和Th17细胞的转录调节因子的表达水平,分别是Bcl-6和ROR-γT。CHB组ROR-γT的表达水平显著性高于IC组(p0.0001),而IC组Bcl-6的表达水平显著性高于CHB组(p0.0001)。 2.CHB患者52周抗病毒治疗中IL-21的动态变化抗病毒治疗52周血清HBV DNA定量、ALT水平及血清IL-21水平的变化抗病毒治疗12周、24周和52周血清HBV DNA定量在CR组(n=14)和NCR组(n=61)之间有显著性差异(p0.0002,p=0.002和p=0.002),两组间血清ALT水平在治疗24周时都降至正常值范围内,且在各时间点无显著性差异。重复测量分析显示血清IL-21水平随治疗时间延长而下降(多因素分析和单因素分析结果分别为p=0.009和p=0.001)且CR组IL-21水平显著性高于NCR组(p=0.004),但VR组与NVR组之间IL-21水平无显著性差异(p=0.23)。在抗病毒治疗12周,CR组血清IL-21水平显著性高于NCR组(p=0.005),但在其他时间点并无统计学差异。尽管在治疗52周时所有CHB患者血清ALT水平恢复正常,但血清IL-21浓度仍显著性高于IT组(p=0.035)。抗病毒治疗中血清IL-21水平和HBV DNA定量对完全应答的预测及验证单因素分析得到具有统计学意义的指标有：抗病毒治疗基线、12周和24周的血清HBV DNA定量,以及治疗12周血清IL-21水平。所有p0.10的指标被纳入多因素分析。构建线性模型预测治疗应答的最佳指标包括治疗12周血清IL-21水平和治疗12周HBV DNA定量(r2=0.31)。交互作用无统计学意义,且治疗12周的血清IL-21与血清HBV DNA皆为独立影响因子(p=0.002,p=0.003)。Logistic回归分析同样显示治疗12周血清IL-21水平和血清HBV DNA定量为独立影响因子(p=0.05,p=0.007)。利用治疗12周血清HBV DNA定量、IL-21水平以及IL-21与HBV DNA定量的比值建立ROC曲线预测抗病毒治疗52周是否产生完全应答。抗病毒治疗12周HBV DNA定量为3.83log10copies/mL时为最佳诊断值,预测完全应答的灵敏度和特异度分别为85.7%和70.4%。抗病毒治疗12周血清IL-21水平为112.3pg/mL时为最佳诊断值,预测完全应答的灵敏度和特异度分别为73.3%和81.8%。抗病毒治疗12周血清IL-21水平低于51.4pg/mL为95%HBeAg血清学转换的阴性预测值。为验证血清IL-21与HBeAg血清学转换之间的关系,选取另一临床试验中的103例非连续观察患者检测其血清IL-21水平,抗病毒治疗12周CR组(n=42)血清IL-21水平显著性高于NCR组(n=61,p=0.004),并且两组在基线血清IL-21水平上具有显著性差异(p=0.003)。抗病毒治疗52周患者外周血分泌IL-21的CD4+T淋巴细胞频数的变化CR组患者IL-21+CD4+T细胞频数的平均值高于NCR组,但未达到统计学差异(p=0.080)。比较两组在各治疗时间点的结果,抗病毒治疗24周CR组的细胞频数显著性高于NCR组(p=0.003)。血清IL-21水平与外周血IL-21+CD4+T细胞频数在各时间点均无相关关系。抗病毒治疗52周血清IL-21水平与PD-1之间的关系重复测量发现治疗52周CD8+T细胞和CD4+T细胞表达PD-1比例显著性下降(p=0.030,p=0.210)。CR组CD8+T细胞和CD4+T细胞表达PD-1比例更高(p=0.110,p=0.040)。在所有20例观察对象中,治疗12周时CD8+T细胞和CD4+T细胞表达PD-1比例较基线显著性下降(p=0.050,p=0.030)。血清IL-21水平与表达PD-1的CD8+T细胞频数正相关(r=0.222,p=0.048)而与表达PD-1的CD4+T细胞频数无关(r=0.111,p=0.328)。 3.IL-21促进T、B细胞应答的体外研究特异性抗原HBcAg刺激后,IC组能够检测到特异性分泌IL-21的CD4+T淋巴细胞的存在,且其频数显著性高于CHB组(p=0.0005)。在HBcAg特异性刺激下,CHB患者CD8+T细胞与IC患者CD8-T细胞经Transwell板共培养后,CHB患者CD8+T淋巴细胞表面IL-21R的细胞频数比例和平均荧光密度(MFI)较培养前显著升高(p=0.006),经IL-21抗体和IL-21R抗体联合阻断后,CD8+T淋巴细胞表面IL-21R水平显著下调(p=0.013)。另外,利用HBcAg/HBeAg与IL-21共同刺激CHB或IC患者PBMC,检测培养上清中HBV特异性抗体的产生,在20例慢性HBV感染者中有5例患者检出anti-HBe存在,绝大多数患者可检出anti-HBc。提示IL-21可能促进B细胞分泌HBV特异性抗体。结论：慢性HBV感染横向研究和抗病毒治疗动态观察的结果都显示：无论是自发的还是药物诱导的HBeAg血清转换患者血清IL-21水平以及外周血分泌IL-21的细胞频数都显著性升高,且抗病毒治疗12周完全应答组血清IL-21水平显著性升高,能够作为独立预测1年治疗发生HBeAg血清转换的重要指标,这对于抗病毒治疗的早期疗效预测及制定个体化治疗方案都具有重要的指导意义。 IC患者外周血病毒特异性分泌IL-21的CD4+T细胞频数显著升高,且在体外实验中能够促进CHB患者CD8+T细胞IL-21R表达增加,而且rhIL-21对B细胞分泌HBV特异性抗体有一定的促进作用,提示IL-21可促进T、B细胞HBV特异性免疫应答,可能在未来慢性乙型病毒性肝炎的免疫治疗中起重要作用。有关IL-21促进HBeAg血清学转换的机制我们将进一步的验证。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R512.62

【参考文献】