布鲁氏菌病实验诊断方法评价及标准化研究

发布时间：2017-03-21 08:02

  本文关键词：布鲁氏菌病实验诊断方法评价及标准化研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：分析近10余年我国人间布鲁氏菌病实验室检测方法的使用现状,并对其敏感度和特异度进行评价；对三种原理不同的核酸提取方法提取核酸的效率及产物质量进行比较；建立布氏菌荧光定量PCR及布氏菌含量的计算方法,探索应用于布鲁氏菌病诊断的可行性；为《布鲁氏菌病诊断标准》的修订提供技术支持。方法：按“布鲁氏菌病／布病”和“实验室检查／诊断方法”关键词组合,在万方数据知识服务平台、中国知网、中文期刊数据库(维普)等中文数据库中检索2004-2014年间有关布病实验室检测的文献。统计各省份各检测方法的检测样本量和各检测方法的灵敏度、特异度及符合率。分别采用离心柱法(以TIANGEN细菌基因组提取试剂盒为代表)磁珠法(以Taco全DNA萃取试剂盒为代表)及水煮法提取浓度分别为1011、1010.5、1010、109.5、109 CFU/ml的布氏菌1 6M菌液,分别以50 μl、100 μl、200 μl(水煮法无洗脱步骤,不区分)的洗脱体积收集产物；用Nanodrop ND-1000分光光度计测量所提取核酸的浓度及纯度等指标,并检测各方法提取的核酸能否进行PCR及荧光定量PC。用平板计数确定布氏菌浓度,用此菌液建立PCR及荧光定量PCR的检测方法,及通过荧光定量PCR推算临床标本布氏菌浓度的参考系。并比较生理盐水菌液与血清模拟样本对荧光定量PCR检测结果的影响,比较不同目的基因引物进行普通PCR的检测下限差异。结果：1.筛选得到检查样本数量及方法相关文献共157篇,其中实验室检查方法准确性相关文献共22篇。由24个省份报告,实际样本检测时间为1954-2012年,共使用14种方法检查了716280份样本。2.检测方法中,检测样本量由大到小为试管凝集试验(SAT,256050份),虎红平板凝集试验(RBT,224699份),皮肤过敏试验(184787份),平板凝集试验(PAT,33018份)等。3.24个省使用SAT,20个省使用RBT,10个省使用皮肤过敏试验,7个省分离布氏菌；检测样本量由大到小为河南(114031份)、内蒙古(104287份)、浙江(93484份)；使用的检测方法由多到少为浙江(9种)、内蒙古(7种)、山东和黑龙江(5种)。4.各检测方法与SAT的符合率最高的是胶体金,为99.77%(9811/9834)；其次为PAT,为97.73%(86/88)；双抗原夹心酶联免疫吸附试验(DAgS-ELISA),96.49%(110/114);RBT,94.55%(2 465/2 607)；人免疫球蛋白G酶联免疫吸附试验(IgG ELISA),86.38%(2068/2394);IgM ELISA,76.23%(1 825/2394);补体结合试验(CFT),69.17%(83/120)；皮肤过敏试验,56.36%(31/55)。5.在获得核酸的产量上,离心柱法和磁珠法都远低于水煮法,而离心柱法稍高于磁珠法。离心柱法和磁珠法在菌液浓度1011～1010.5CFU/ml可得到最高浓度的产物,水煮法所得产物浓度随着菌液浓度的升高呈线性增加。离心柱法中,核酸浓度随洗脱体积的增加而减少,但对总产量的影响不大,故洗脱体积在50 μ 1～200 μ 1范围内均可。磁珠法随着洗脱体积的增加,核酸浓度下降得更快,即在50μ1时,总产量最高,2001x1时总产量最低。6.在纯度上,水煮法最高(A260/A280、A260/A230比值最接近核酸对应的标准范围),离心柱法其次,磁珠法最低。7.三种方法重复性都很好,结果稳定；且PCR和荧光定量PCR结果均为阳性。8.以b csp31作为目的基因,在108,～103CFU/ml范围内可得到荧光定量PCR典型扩增。Ct值在108～103CFU/ml范围内与菌液浓度的对数值呈线性,标准曲线,y=-3.0574x+46.171,R2=0.9968。9.生理盐水菌液与血清模拟样本荧光定量PCR的检测下限相同,为103CFU/ml,各浓度Ct值没有显著差异。用B4/B5对两种样本进行普通PCR,检测下限也相同,为106CFU/ml。10.用IS313/IS639、brucl/bruc5分别检测菌液样本。IS313/IS639检测下限为105 CFU/ml,brucl/bruc5的检测卜限为10CFU/ml。结论：1.SAT的应用范围最广,此次研究所涉及的24个省份都采用了,且检测样本量也是最大。RBT的检测样本量及使用省份其次,且灵敏度特异度均达到94%以上。2.近十年,皮肤过敏试验和PAT的使用单位相对RBT较少,检查样本量也小,分别为184787份及33018份。3.CFT、抗人免疫球蛋白试验(Coomb's)操作繁琐,使用范围小,CFT仅一个省份出现了报道,Coomb's仅两省报道,近十年检查样本量不足150份。4.胶体金操作简便,可现场使用。检测样本量不大,只有浙江省报道。5. IgG ELISA的灵敏度、特异度均高,IgM ELISA灵敏度一般,但是可以分别检测IgG及IgM,对布病病程判断有一定参考价值。检测样本量不大,集中在内蒙古、山东、北京。6.相比实验室常用的离心柱核酸提取法,磁珠法操作简单,重复性好,耗时短,所得核酸完整度高,可用于样本量大且后接大片段核酸实验研究。7.水煮法的产物浓度和纯度都较高,耗时及费用低,重复性好,但核酸断裂严重,适用于样本量大,低成本,后接小片段PCR扩增时的核酸提取。8.菌液浓度的对数值与荧光定量PCR的Ct值满足关系式y=-3.0574x+46.171,可用于估计患者标本中的布氏菌含量。9.荧光定量PCR可检测布氏菌下限浓度为103CFU/ml,普通PCR检测布氏菌下限浓度为106CFU/ml。10.普通PCR检测IS313/IS639的检测下限为105 CFU/ml,B4/B5检测下限为106 CFU/ml, Brucl/Bruc5检测下限为107 CFU/ml。
【关键词】：布鲁氏菌病 诊断试验 系统评价 布鲁氏菌 核酸提取 荧光定量PCR PCR
【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R516.7
【目录】：

• 缩略词6-7
• 中文摘要7-10
• Abstract10-14
• 前言14-21
• 第一部分 2004-2014年人间布鲁氏菌病实验室检测方法系统评价21-31
• 1. 材料与方法21-23
• 2. 结果与分析23-27
• 3. 讨论27-30
• 4. 小结与建议30-31
• 第二部分 三种方法提取布鲁氏菌核酸的对比研究31-43
• 1. 实验材料31-32
• 2. 实验方法32-36
• 3. 结果36-40
• 4. 讨论40-41
• 5. 小结41-43
• 第三部分 布鲁氏菌PCR及荧光定量PCR临床标本检测43-54
• 1. 实验材料43-44
• 2. 实验方法44-47
• 3. 结果47-52
• 4. 讨论52-53
• 5. 小结53-54
• 参考文献54-58
• 附录1：布鲁氏菌病诊断标准送审稿58-74
• 附录2：作者简介74-75
• 致谢75

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 曹岩,温娟,郑强;国外布鲁氏菌病及相关研究的文献统计分析[J];地方病通报;2000年02期

2 罗兴建,汤强;重庆市发生布鲁氏菌病1例报告[J];重庆医学;2001年06期

3 石明才,李保安,张连生,史建国,柴丽明,吕红梅,李莉;新疆农五师88团人群布鲁氏菌病监测报告[J];地方病通报;2001年02期

4 张立华,杨国库;因运输山羊感染布鲁氏菌病一例[J];内蒙古医学杂志;2001年06期

5 张国侠,岳少文,柴植人,马英华,李福兴;特殊途径感染的布鲁氏菌病3例报告[J];中国地方病学杂志;2002年03期

6 王进云,安格日格;草原旅行与布鲁氏菌病预防[J];口岸卫生控制;2002年01期

7 唐敏丽,聂磊;齐齐哈尔部分地区布鲁氏菌病的血清学检测与结果分析[J];齐齐哈尔医学院学报;2002年11期

8 孙瑞敏,刘培伟;布鲁氏菌病14例报告[J];中国地方病学杂志;2003年03期

9 罗红燕,闻海鸣;呼伦贝尔市1956～2002年布鲁氏菌病调查[J];中国公共卫生;2003年11期

10 贺晓燕,马鲁胜,张霞;1起布鲁氏菌病疫情的调查[J];预防医学文献信息;2004年03期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 周继章;宫晓炜;曹小安;陈启伟;郑福英;费媛媛;邱昌庆;;我国部分省(区)动物布鲁氏菌病流行情况调查[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第三次学术研讨会论文集[C];2012年

2 周继章;宫晓炜;曹小安;郑福英;蔺国珍;王光华;费媛媛;邱昌庆;;2009-2010年我国部分省(区)动物布鲁氏菌病流行情况调查[A];第3届全国人畜共患病学术研讨会论文集[C];2011年

3 牛金星;任德新;张鑫荣;;滩羊布鲁氏菌病的检测[A];中国畜牧兽医学会养羊学分会2014年全国养羊生产与学术研讨会议论文集[C];2014年

4 杜美兰;罗秋菊;崔宏伟;贾少菊;;布鲁氏菌病的健康宣教[A];中华护理学会2009全国传染病护理学术交流暨专题讲座会议论文汇编[C];2009年

5 毛开荣;;布鲁氏菌病研究进展[A];全国人畜共患病学术研讨会论文集[C];2006年

6 刘东立;;抗菌素联合用药治疗布鲁氏菌病效果观察[A];全国人畜共患病学术研讨会论文集[C];2006年

7 朱匡纪;蔡祖华;邵丰尧;黄秀琴;王菊丛;楼妙芬;;2005年婺城区布鲁氏菌病国家级监测点监测报告[A];全国人畜共患病学术研讨会论文集[C];2006年

8 叶丽萍;许国章;鲁锋;孙亚维;张吉楠;董红军;;2002～2005年宁波市职业重点人群布鲁氏菌病监测结果分析[A];全国人畜共患病学术研讨会论文集[C];2006年

9 蒋轶文;白羽;;职业性布鲁氏菌病研究进展[A];中华预防医学会第十八次全国职业病学术交流大会论文汇编[C];2009年

10 郑源强;吴岩;毕力夫;;布鲁氏菌病检测、防控措施与疫苗研究进展[A];2011新型疫苗与抗体创制关键技术及质量控制研讨会论文集[C];2011年

中国重要报纸全文数据库 前10条

1 记者 韦良俊;我区须加强防控布鲁氏菌病[N];阿勒泰日报;2008年

2 中国农业科学院 邱昌庆 研究员;对奶牛布鲁氏菌病防制的思考[N];中国畜牧兽医报;2005年

3 中国农业科学院 邱昌庆研究员;对奶牛布鲁氏菌病防制的思考[N];中国畜牧兽医报;2005年

4 刘朝江;预防人畜共染布鲁氏菌病[N];农民日报;2014年

5 中国兽药监察所 副研究员 毛开荣;羊布鲁氏菌病的防治[N];中国畜牧水产报;2000年

6 记者 蒋中意;我市被卫生部定为布鲁氏菌病检测点[N];金华日报;2005年

7 施水泉邋记者 李水根;确诊布鲁氏菌病有了“快枪手”[N];健康报;2007年

8 记者 马艳军;落实五项措施 控制布鲁氏菌病疫情[N];内蒙古日报(汉);2006年

9 记者 陈艳阳邋通讯员 衣晓峰 时长山;布鲁氏菌病疫情上升值得警惕[N];大众卫生报;2007年

10 张建平;加强布鲁氏菌病的防治[N];河北经济日报;2008年

中国博士学位论文全文数据库 前4条

1 殷德辉;基于多表位融合蛋白的人布鲁氏菌病检测技术研究[D];吉林大学;2016年

2 王楠;重组口蹄疫病毒VP1基因的布鲁氏菌病活疫苗的构建及其生物学活性研究[D];吉林大学;2016年

3 李向阳;内蒙古通辽地区奶牛布鲁氏菌病流行病学调查和感染机理初步分析[D];吉林大学;2013年

4 甄清;人布鲁氏菌病标准化PCR诊断方法及BP26基因标记疫苗研究[D];吉林大学;2009年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 李秋丽;利用统计方法分析某地区布鲁氏菌病的流行特征[D];东北师范大学;2007年

2 黎银军;我国布鲁氏菌病时空分布及风险预测研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2013年

3 郝博;一些具有间接传染的布鲁氏菌病动力学模型及其稳定性分析[D];西北农林科技大学;2015年

4 武燕;靖边县奶牛结核病和布鲁氏菌病检测与分析[D];西北农林科技大学;2015年

5 束鸿鹏;布鲁氏菌病血清学检测方法比较和云南陆良奶山羊布鲁氏菌病流行病学调查[D];南京农业大学;2014年

6 何宗霖;阿克苏地区家畜布鲁氏菌病流行病学调查及防控对策[D];新疆农业大学;2014年

7 杨志光;中国布鲁氏菌病疫情形势及防治对策[D];中国疾病预防控制中心;2010年

8 韩丹;新疆布鲁氏菌病患者外周血T细胞亚群的临床分析[D];新疆医科大学;2016年

9 王锐泽;2009~2012年吉林省松原市布鲁氏菌病门诊就诊人群流行病学特征分析[D];吉林大学;2016年

10 韦明;规模化牧场布鲁氏菌病血清学调查与iELISA检测方法的建立[D];宁夏大学;2016年

  本文关键词：布鲁氏菌病实验诊断方法评价及标准化研究，由笔耕文化传播整理发布。

，

本文编号：259271