JQ1抑制p300乙酰转移酶活性减轻日本血吸虫感染小鼠的肝脏损伤

发布时间：2020-11-19 04:38

　　 【研究背景】日本血吸虫病至今仍是一个重大公共卫生问题,严重影响人类健康和社会经济发展,主要分布在热带和亚热带地区,我国是日本血吸虫病流行最严重的国家之一。日本血吸病主要危害就是肝脏的虫卵性肉芽肿炎症和随后的肝脏纤维化,但至今尚无理想的的治疗手段,因此在深入研究肝脏的肉芽肿炎症和纤维化的相关机制的基础上,寻找新的治疗靶点,对肝纤维化治疗至关重要。Th17属于CD4~+T细胞亚群,以大量分泌细胞因子IL-17为特征。RORγt是Th17分化过程中的关键转录因子,它通过直接激活IL-17的转录促进Th17的分化。p300是广泛表达的乙酰转移酶,主要由结构域Bd、PHD、RING和HAT组成,其中HAT是乙酰转移酶功能结构域,Bd的功能是识别底物中乙酰化的赖氨酸并与之结合,以产生正反馈并维持p300的乙酰化作用,因此Bd对HAT的活性有重要调节作用。JQ1是溴结构域和外终端域(BET)蛋白家族抑制剂,它可以竞争性结合于Bd,阻止Bd与乙酰化的赖氨酸结合,从而导致乙酰化的组蛋白/非组蛋白无法与Bd结合招募更多的乙酰转移酶p300,使p300的乙酰化作用无法维持,抑制p300对相关基因表达的促进作用。本课题组前期研究表明:Th17/IL-17不仅促进急性期虫卵肉芽肿炎症,还发挥重要的促纤维化功能;p300通过乙酰化转录因子RORγt的81位赖氨酸(K81),上调RORγt介导的IL-17的转录激活,从而促进了Th17的分化。那么在血吸虫感染模型中,JQ1是否可以通过抑制p300乙酰化作用下调RORγt介导的IL-17的转录,从而影响Th17的分化;继而减轻肝脏虫卵肉芽肿炎症及纤维化呢?以及JQ1是否通过与p300竞争溴结构域(BRD)来发挥作用呢?【研究方法】1.日本血吸虫感染小鼠模型的建立及JQ1处理为排除JQ1影响成虫产卵的因素,本研究在血吸虫感染的小鼠模型中,于感染6周后统一进行吡喹酮灌胃杀虫,再进行JQ1处理。6~8周的SPF级C57/BL6小鼠随机均分为3组,分别为正常对照组、DMSO溶剂对照组和JQ1处理组;经皮感染感染日本血吸虫尾蚴20±2条;感染后42天吡喹酮灌胃(300mg/kg/d),共2天;感染后45天开始注射JQ1(50mg/kg/d)/DMSO,共15天,感染后60天处死小鼠进行如下实验:(1)眼球取血分离血清,-80℃冻存,检测转氨酶水平;(2)成虫和虫卵计数;(3)记录小鼠体重、肝脏和脾脏的重量,计算肝脾系数;(4)常规固定部分肝脏组织,石蜡包埋进,进行HE染色、天狼星红染色;(5)冻存部分肝组织:测肝脏组织中的羟脯氨酸含量;RT-qPCR检测肝组织中的IL-17和RORγt的基因水平;(6)分离肝脏肉芽肿细胞:流式检测IL-17和转录因子RORγt阳性细胞数;2.JQ1抑制p300乙酰酶活性的机制研究(1)两段p300蛋白的表达和鉴定;经过扩增两段p300目的基因,改造表达载体pcDNA3.1(+),构建表达质粒瞬时转染ExpiCHO细胞,真核表达包含Bd和HAT结构域的p300蛋白以及只有HAT结构域的p300蛋白;(2)JQ1对两段不同的p300蛋白乙酰转移酶活性的影响;JQ1(250nM)处理后的两段p300蛋白4h,使用Histone Acetyltransferase Activity Assay Kit酶活试剂盒检测乙酰酶活性。【研究结果】1.JQ1减轻了日本血吸虫虫卵导致的肝脏肉芽肿炎症和肝纤维化。2.JQ1下调肝组织中IL-17和RORγt的表达水平;肉芽肿细胞中Th17细胞比例。3.JQ1抑制含有Bd结构域的p300蛋白的乙酰转移酶活性,而对不含Bd的p300蛋白的乙酰转移酶活性没有明显影响。【结论】1.JQ1能够减轻日本血吸虫虫卵导致的肝脏肉芽肿炎症及肝纤维化;2.可能通过竞争性地结合Bd结构域抑制p300的乙酰化下调RORγt介导的IL-17的转录,从而影响Th17的分化;继而减轻虫卵诱导的肝脏病变。
【学位单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R532.21
【文章目录】：
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中文摘要
ABSTRACT
1.前言
2.材料与方法
3.结果
4.讨论
5.结论
参考文献
个人简历
致谢
综述
    参考文献

【参考文献】

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本文编号：2889712