维生素D诱导自噬对巨噬细胞清除结核分枝杆菌的作用的实验研究

发布时间：2017-04-10 11:11

  本文关键词：维生素D诱导自噬对巨噬细胞清除结核分枝杆菌的作用的实验研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：机体内巨噬细胞(macrophage, MΦ)与结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)的相互作用影响着结核病(tuberculosis,TB)的发展方向,增强Mφ对胞内Mtb的杀灭能力成为治疗TB和减少发病的重要策略。维生素D通过与维生素D受体(Vitamin D receptor,VDR)的结合,对诱导Mφ自噬以及自噬溶酶体的成熟发挥着关键调节作用。本课题旨在研究维生素D诱导巨噬细胞产生自噬并清除巨噬细胞内Mtb的作用。方法：(1)建立Mφ感染Mtb的体外模型：使用豆蔻酰佛波醇乙酯(phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA)诱导人单核巨噬细胞系U937分化,使之具有吞噬能力,分化后的U937细胞经Mtb标准人型毒力株H37Rv处理,建立Mφ感染Mtb的体外模型。(2)实验分组：分化的U937细胞随机分为：阴性对照组(RPMI1640培养基,24小时)、维生素D组[100pM 1,25 (OH) 2D3,24小时]、自噬抑制剂+维生素D组[10μM 3-甲基腺嘌呤(3-methyl adenine,3-MA)+100pM 1,25(OH) 24小时]、阳性对照组(10nM雷帕霉素,18小时),各组细胞以H37Rv感染(细菌：细胞=10：1)4小时。(3)检测相关指标：感染后第4天,利用台盼蓝染料排斥试验评价药物的细胞毒性。半定量RT-PCR检测自噬相关基因(autophagy-related genes,Atg)Atg5、Beclin-1及人抗菌肽LL-37、微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain3,LC3) B mRNA的表达。Western Blotting检测LL-37、 LC3B-Ⅱ蛋白的表达。分别计数感染后第1、4天细胞内Mtb的菌落形成单位(colony forming units,cfu)。流式细胞术计数感染后第4天LC3B-Ⅱ+和／或结核分枝杆菌抗原85 A+(Ag85A+)的细胞数。结果：(1)实验中台盼蓝染料排斥试验显示细胞存活率均达96%以上；(2)与对照组相比,半定量RT-PCR检测发现维生素D组Atg5, Beclin-1、LL-37、LC3B mRNA的表达增强(P0.01);(3)Western Blotting检测发现维生素D组LL-37蛋白的表达增加(P0.01)及LC3B-Ⅱ蛋白的表达增加(P0.05)；(4)感染后第1天维生素D组细胞内Mtb的菌落数无明显改变(P0.05),而感染后第4天维生素D组细胞内Mtb的菌落数显著减少(P0.01)；(5)与阴性对照组比较,流式细胞术显示维生素D组LC3B-Ⅱ+-细胞增多,Ag85A+-细胞减少,且LC3B-Ⅱ+-Ag85A--细胞增加(维生素D组65.1%比阴性对照组2.22%)；(6)与维生素D组相比,在白噬抑制剂3-MA+维生素D组中,不但Atg5. Beclin-1、LC3B的mRNA表达受到抑制,LL-37的mRNA表达减少,LL-37、LC3B-Ⅱ蛋白的表达较维生素D组减少；而且3-MA抑制了1,25(OH)2D3对感染后第4天细胞内Mtb的菌落数的减少,同时抑制了1,25(OH)2D3对LC3B-Ⅱ+-Ag85A--细胞的增加。结论：维生素D能够诱导巨噬细胞产生自噬作用,并进一步有助于巨噬细胞清除结核分枝杆菌。
【关键词】：维生素D 自噬 结核分枝杆菌 巨噬细胞
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R52
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照5-8
• 中文摘要8-11
• 英文摘要11-14
• 前言14-16
• 第一部分 维生素D对感染结核分枝杆菌的巨噬细胞的自噬作用的影响16-33
• 1 材料和方法16-27
• 2 结果27-30
• 3 讨论30-33
• 第二部分 维生素D诱导巨噬细胞的自噬作用与巨噬细胞清除胞内结核分枝杆菌的关系33-42
• 1 材料和方法33-36
• 2 结果36-38
• 3 讨论38-42
• 全文总结42-43
• 参考文献43-46
• 文献综述46-54
• 参考文献50-54
• 致谢54-55
• 攻读硕士学位期间发表的论文55

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本文编号：296582