梅毒螺旋体膜蛋白Tp92致炎作用机制的初步研究

发布时间：2017-04-17 13:09

  本文关键词：梅毒螺旋体膜蛋白Tp92致炎作用机制的初步研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：本文选择在机体非特异性免疫中发挥重要抗感染作用的巨噬细胞和梅毒螺旋体早期感染中主要接触的微血管内皮细胞(HMEC-1)为靶细胞,来探讨Tp92是否可作为一个触发器启动宿主细胞主要炎症信号转导通路,并筛选出Tp92可能的靶细胞炎症信号转导通路,为进一步揭示Tp致病的分子机制打下基础。本实验用Tp92蛋白分别刺激巨噬细胞和HMEC-1细胞,ELISA检测其促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌水平。并根据预测的My D88/NF-κB、MAPKs/p38和NLRP3/Caspase-1三条信号转导通路,分别用其特异性抑制剂PDTC(Pyrrolidinedithiocarbamic acid)、SB202190和Z-YVAD-FMK阻断,ELISA检测Tp92作用靶细胞前后促炎细胞因子的分泌水平差异。若促炎细胞因子分泌水平有显著下降,既用Western blot检测Tp92作用靶细胞前后My D88、NF-κB、MAPK1/2、p38 MAPK、Caspase-1和NLRP3分子的表达水平差异;最后通过总活性比色法定量检测Tp92作用靶细胞前后乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)的活性变化。研究结果如下:有效表达一个约92k Da大小的分泌性蛋白,经纯化后纯度达85%以上;一定浓度的Tp92蛋白可显著诱导巨噬细胞和HMEC-1细胞产生TNF-α、IL-1β和IL-6;特异性阻断My D88/NF-κB和MAPKs/p38信号通路后,ELISA结果显示巨噬细胞和HMEC-1细胞分泌的促炎细胞因子较阻断前均无明显降低,LDH活性检测结果显示LDH的活性也无明显差异,而特异性阻断NLRP3/Caspase-1信号通路后,ELISA结果显示巨噬细胞和HMEC-1细胞分泌的TNF-α、IL-6和IL-1β较阻断前有明显降低(P0.05);Western blot结果显示Caspase-1和NLRP3分子的表达水平较阻断前均有明显降低;LDH活性检测结果显示LDH的活性较阻断前也有明显降低(P0.01)。本实验得出结论,Tp92能促进巨噬细胞和HMEC-1细胞产生促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6,并且Tp92致使巨噬细胞和HMEC-1细胞产生炎症反应可能是通过NLRP3/Caspase-1途径。
【关键词】：梅毒螺旋体 Tp92 炎症 信号通路
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R759.1
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-12
• 第1章 绪论12-16
• 第2章 实验材料16-20
• 2.1 主要实验仪器16-17
• 2.2 载体、菌株及细胞株17
• 2.3 主要实验试剂17-20
• 2.3.1 主要试剂盒17
• 2.3.2 主要实验试剂17-18
• 2.3.3 培养基及溶液18-19
• 2.3.4 其他19-20
• 第3章 实验方法20-40
• 3.1 Tp92目的基因的扩增20-23
• 3.1.1 Tp Nichols标准株全基因组DNA模板的提取20-21
• 3.1.2 Tp92的引物设计21
• 3.1.3 PCR扩增21-22
• 3.1.4 PCR产物的纯化22-23
• 3.2 构建Tp92原核表达载体23-28
• 3.2.1 pET-43.1a(+)质粒的扩增与纯化23-25
• 3.2.2 制备感受态细菌25-26
• 3.2.3 Tp92和pET-43.1a(+)质粒的双酶切26
• 3.2.4 纯化双酶切后的Tp92和pET-43.1a(+)质粒26
• 3.2.5 Tp92和pET-43.1a(+)质粒的连接26-27
• 3.2.6 连接产物的转化27
• 3.2.7 重组质粒的筛选与鉴定27-28
• 3.3 Tp92重组蛋白的表达、纯化与鉴定28-33
• 3.3.1 摸索Tp92重组蛋白的最佳表达条件28
• 3.3.2 Tp92重组蛋白的纯化28-30
• 3.3.3 Tp92重组蛋白的浓缩30-31
• 3.3.4 Tp92重组蛋白去内毒素31
• 3.3.5 Western Blot鉴定31-32
• 3.3.6 蛋白浓度的测定32-33
• 3.4 细胞培养和传代33
• 3.4.1 THP-1 细胞33
• 3.4.2 HMEC-1 细胞33
• 3.5 初步探索Tp92的致炎作用33-36
• 3.5.1 Tp92刺激靶细胞33-35
• 3.5.2 ELISA检测促炎细胞因子TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平35-36
• 3.6 ELISA检测阻断各信号通路前后各促炎细胞因子的水平变化36-37
• 3.6.1 巨噬细胞36
• 3.6.2 HMEC-1 细胞36-37
• 3.7 Western Blot检测阻断各信号通路前后关键分子的水平变化37-38
• 3.7.1 巨噬细胞37
• 3.7.2 HMEC-1 细胞37-38
• 3.7.3 Western Blot检测38
• 3.8 LDH法检测阻断各信号通路前后靶细胞内LDH的水平变化38-40
• 3.8.1 巨噬细胞38-39
• 3.8.2 HMEC-1 细胞39
• 3.8.3 乳酸脱氢酶检测39-40
• 第4章 实验结果40-56
• 4.1 Tp92目的蛋白的诱导表达与鉴定40-44
• 4.1.1 Tp92基因的PCR扩增结果40
• 4.1.2 Tp92/pET-43.1a(+)重组质粒的菌液PCR鉴定40-41
• 4.1.3 Tp92/pET-43.1a(+)重组质粒的双酶切鉴定41-42
• 4.1.4 Blast比对42
• 4.1.5 Tp92重组蛋白的表达42-43
• 4.1.6 Tp92重组蛋白纯化、去内毒素之后的Western Blot分析43-44
• 4.1.7 测定Tp92重组蛋白最终浓度44
• 4.2 Tp92刺激不同时间对细胞因子分泌的影响44-47
• 4.3 PDTC对Tp92诱导靶细胞分泌促炎细胞因子的影响47-48
• 4.4 SB202190对Tp92诱导靶细胞分泌促炎细胞因子的影响48-50
• 4.5 Z-YVAD-FMK对Csapase-1 和NLRP3的表达及促炎细胞因子的分泌的影响50-53
• 4.6 LDH法检测阻断各信号通路前后靶细胞内LDH的水平变化53-56
• 第5章 讨论56-62
• 第6章 结论62-64
• 参考文献64-70
• 文献综述70-100
• 梅毒螺旋体外膜蛋白 Tp92 及其同源蛋白的研究进展70-81
• 参考文献77-81
• Autophagy, an inhibitor of NLRP3 inflammasome activation81-100
• References92-100
• 作者攻读学位期间的科研成果100-102
• 致谢102

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 吴冷;王骏;赵蕾;吴亚菲;;核苷酸结合寡聚化结构域样受体热蛋白结构域亚家族成员3炎症小体的活化调节与牙周疾病的关系[J];国际口腔医学杂志;2015年06期

2 甘霖;赵飞骏;;梅毒螺旋体外膜蛋白Tp92及其同源蛋白的研究进展[J];微生物学免疫学进展;2014年01期

  本文关键词：梅毒螺旋体膜蛋白Tp92致炎作用机制的初步研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：313279