利用COⅠ和Cyt b分析青南地区棘球绦虫分离株基因型及其蛋白质表达Western-blot初步分析

发布时间：2017-05-02 10:01

  本文关键词：利用COⅠ和Cyt b分析青南地区棘球绦虫分离株基因型及其蛋白质表达Western-blot初步分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的 1.运用棘球绦虫线粒体细胞色素C氧化酶亚单位Ⅰ(COⅠ)基因及线粒体细胞色素B(Cyt B)基因对青海省中间宿主体内棘球绦虫行基因多态性分析,确定青海省棘球绦虫基因型。2.初步分析棘球蚴与泡球蚴的蛋白表达差异,为包虫病诊断抗原、候选疫苗抗原、药物作用靶分子抗原的分离、鉴定提供理论依据。方法 1.利用适合的DNA分析软件对40条不同中间宿主体内的棘球绦虫(14条人体分离株、21条羊肝分离株、5条羊肺分离株)COⅠ基因及43条人体分离株Cyt B基因行同源性、碱基组成性分析并计算序列间的遗传距离,绘制细粒棘球绦虫的单倍型网络图,构建NJ树与Bayesian树。2.以分离的不同人体细粒棘球蚴的囊壁、囊液、原头节及泡球蚴粗提取蛋白为抗原,采用SDS-PAGE方法分析细粒棘球蚴不同人体分离株的蛋白表达,用已确诊包虫病患者血清作为一抗,采用Western-blot方法分析两型棘球绦虫的特异性蛋白。结果 1.基于COⅠ基因及Cyt B基因成功构建棘球绦虫单倍型网络图及系统发育树。2.在816个COⅠ基因核苷酸位点中,241个可变位点,149个简约信息位点。A、T、C、G碱基频率分别为0.163、0.491、0.103、0.242。所有序列平均遗传距离为0.068,猪带绦虫和CH3之间遗传距离最大0.204。3.人体分离株Cyt B基因的541个核苷酸序列,211个可变位点,127个简约信息位点。碱基频率:A=0.191,C=0.101,G=0.24,T=0.468。所有序列平均遗传距离为0.054,猪带绦虫和CH14、ZH22之间遗传距离为0.311。4.不同人体细粒棘球蚴原头节蛋白条带丰富,囊壁和囊液蛋白无明显差异,117KD、49KD、34KD附近均出现较亮的特异性条带。5.泡球蚴蛋白在72KD、55KD、26KD附近出现浓集条带,Western-blot分析结果示:55KD和26KD附近出现特异性条带。结论 1.基于COⅠ基因及Cyt B基因分析不同中间宿主体内的棘球绦虫分离株,共鉴定两种虫体,分别为细粒棘球绦虫与多房棘球绦虫。2.细粒棘球绦虫均为G1基因型,用于分析的单倍体型在NJ树与Bayesian树中呈现梳齿状,存在种内突变。3.CH14为青藏高原的优势单倍型。4.细粒棘球蚴蛋白在不同人体之间表达差异不大,但同一虫体之间囊壁、原头节、囊液蛋白表达差异大。5.泡球蚴蛋白在不同地区、不同人体之间表达不同。
【关键词】：COⅠ基因 Cyt B 基因 包虫病
【学位授予单位】：青海大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R532.32
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 主要符号对照表11-12
• 第1章 前言12-16
• 第2章 基于COⅠ基因对青南地区棘球绦虫的系统发育分析16-29
• 2.1 材料和方法16-19
• 2.1.1 材料16-17
• 2.1.1.1 样本来源16
• 2.1.1.2 试验仪器16-17
• 2.1.1.3 试剂17
• 2.1.1.4 试剂配制17
• 2.1.2 方法17-19
• 2.1.2.1 基因组DNA抽提和PCR扩增、测序17-18
• 2.1.2.2 COⅠ基因序列比对分析18-19
• 2.2 结果19-27
• 2.2.1 琼脂糖凝胶电泳分析结果19-20
• 2.2.2 COⅠ基因序列检测结果20-27
• 2.2.2.1 序列同源性的分析20
• 2.2.2.2 序列碱基组成及饱和性检验20-22
• 2.2.2.3 棘球绦虫的单倍型分析22-24
• 2.2.2.4 发育树的构建24-27
• 2.3 讨论27-28
• 2.4 小结28-29
• 第3章 基于Cyt B基因对青海藏区棘球绦虫系统发育分析29-37
• 3.1 材料和方法29-31
• 3.1.1 材料29-30
• 3.1.1.1 样本来源29
• 3.1.1.2 仪器29
• 3.1.1.3 试剂29-30
• 3.1.1.4 试剂配制30
• 3.1.2 方法30-31
• 3.1.2.1 基因组DNA抽提30
• 3.1.2.2 PCR扩增基因组DNA30
• 3.1.2.3 Cyt B基因序列比对分析30-31
• 3.2 结果31-35
• 3.2.1 Cyt B基因琼脂糖凝胶电泳分析结果31
• 3.2.2 Cyt B基因序列检测结果31-35
• 3.2.2.1 序列同源性的分析31
• 3.2.2.2 序列碱基组成及饱和性检验31-33
• 3.2.2.3 单倍型分析33-34
• 3.2.2.4 发育树的构建34-35
• 3.3 讨论35-36
• 3.4 小结36-37
• 第4章 人体棘球蚴与泡球蚴蛋白表达差异初步分析37-47
• 4.1 材料与方法37-43
• 4.1.1 材料37-40
• 4.1.1.1 试验标本37
• 4.1.1.2 主要仪器37-38
• 4.1.1.3 试验试剂38
• 4.1.1.4 试剂配制38-40
• 4.1.2 试验标本的分离40-43
• 4.1.2.1 棘球蚴分离方法40
• 4.1.2.2 蛋白的提取40-41
• 4.1.2.3 蛋白的定量41
• 4.1.2.4 SDS-PAGE凝胶电泳41-42
• 4.1.2.5 Western-blot分析42-43
• 4.2 结果43-44
• 4.2.1 不同人体细粒棘球蚴蛋白考马斯亮蓝染色和Western-blot分析43
• 4.2.2 不同地区泡球蚴蛋白考马斯亮蓝染色和Western-blot分析43-44
• 4.3 讨论44-46
• 4.4 小结46-47
• 参考文献47-52
• 全文总结52-53
• 今后的展望53-54
• 创新点总结54-55
• 致谢55-56
• 附录56-65
• 综述65-75
• 参考文献70-75
• 个人简历75

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本文编号：340715