梅毒螺旋体粘附素Tp0751重组菌影制备与免疫活性的初步研究

发布时间：2017-05-16 02:01

  本文关键词：梅毒螺旋体粘附素Tp0751重组菌影制备与免疫活性的初步研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：[目的]构建重组梅毒螺旋体(Tp)黏附素Tp0751的大肠埃希菌菌影(EBG)(r Tp0751-EBG),检测其免疫活性,为深入探讨其在抗Tp感染中的潜在免疫保护作用奠定基础。[方法](1)EBG的制备与鉴定:将含有噬菌体PHi X174裂解基因E的质粒p HH43转化入E.coli DH5α,温控诱导使其形成BG并计算裂解效率,琼脂糖DNA电泳和透射电镜(TEM)鉴定。(2)膜锚定载体的构建与表达:PCR扩增膜锚定基因E'(含linker),与p ET28a-Tp0751构建膜锚定载体p ET28a-E'-Tp0751,转化E.coli BL21诱导表达,WB鉴定E'-Tp0751的表达。(3)r Tp0751-EBG表达质粒的构建:将含裂解基因盒E-box的p HH43与p ET-32a质粒酶切、连接,构建重组质粒p ET32a-E-box,再将其p ET28a-E'-Tp0751构建重组表达质粒p ET-28a-E'-Tp0751-E-box。(4)r Tp0751-EBG表达与鉴定:将p ET28a-E'-Tp0751-E-box转化E.coli BL21,28℃诱导表达Tp0751,升温至42℃热诱导裂解,计算裂解率。WB鉴定Tp0751的表达;TEM鉴定BG。(5)动物免疫:分别用r Tp0751-EBG肌注、r Tp0751-EBG鼻滴、r Tp0751肌注(加弗氏佐剂)、EBG肌注及PBS肌注途径免疫C57BL/6小鼠3次。每次免疫前及末次免疫后第10d收集血清和生殖道灌洗液,末次免疫后第10d制备小鼠脾细胞。(6)r Tp0751-EBG免疫活性测定:用间接ELISA法检测血清特异性抗体Ig G抗体及生殖道灌洗液中s Ig A抗体水平,CCK-8法检测r Tp0751刺激小鼠脾淋巴细胞增殖,间接ELISA检测IFN-γ表达水平。[结果](1)EBG制备与鉴定:42℃下p HH43上E基因被激活导致E.coli裂解形成BG,裂解率可达98.13%;琼脂糖凝胶电泳未观察到DNA条带,TEM显示绝大部分细菌都裂解成空泡状并保持细菌基本形态。(2)膜锚定载体的构建与表达:PCR扩增出大小约为180 bp左右的片段,与膜锚定基因E'一致;SDS-PAGE显示一分子量约28KDa的可溶性蛋白,WB显示该蛋白仅与Tp感染兔血清反应。(3)r Tp0751-EBG表达质粒的构建、表达与鉴定:酶切及测序结果表明含有目的基因Tp0751和裂解基因盒E-box的重组质粒构建成功。经28℃诱导表达一分子量约28 KDa大小的明显条带,WB显示其仅与Tp感染兔血清反应。在42℃诱导重组BG的OD600值开始下降,裂解率为96.37%。TEM鉴定结果与EBG结果类似。(4)r Tp0751-EBG诱导系统和黏膜体液免疫应答水平:r Tp0751-EBG肌注组、r Tp0751-EBG鼻滴组和r Tp0751肌注组小鼠血清特异性Ig G水平随免疫次数增加而增加,第4周达到最大值,抗体效价均高于1，

本文编号：369323