干扰素刺激基因I6（ISG16）的克隆表达及其对丙型肝炎病毒和I型干扰素信号通路的影响研究

发布时间：2017-05-18 01:00

  本文关键词：干扰素刺激基因I6（ISG16）的克隆表达及其对丙型肝炎病毒和I型干扰素信号通路的影响研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景：丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus, HCV)引起的慢性丙型肝炎是一种严重的传染性肝脏疾病,目前全球感染者约1.5亿。感染HCV后,只有20%的感染者可以自发清除病毒,而且HCV感染造成的慢性化程度较高,是引起肝硬化、肝纤维化以及肝癌的主要原因之一。丙型肝炎的标准治疗方法是聚乙二醇干扰素(pegylated-interferon, PEG-IFN)联合利巴韦林(Ribavirin, RBV),但是存在疗程长、费用高、副作用大等缺陷。本课题组在前期研究中使用基因芯片技术从采用干扰素治疗的丙肝患者有效和无效病人肝组织中筛选出18个差异表达基因,其中,在治疗无效患者的治疗前的肝穿组织中,干扰素刺激基因16(interferon-stimulated gene 16, ISG16)呈现高表达。ISG16是最早发现的能够被Ⅰ型干扰素诱导的干扰素刺激基因之一但是ISG16对HCV复制以及Ⅰ型干扰素信号通路的影响还没有相关研究。目的：在HCVcc体外培养细胞模型(Huh7.5.1细胞)和HCV复制子细胞(Conlb细胞)中高表达ISG16,研究ISG16高表达对HCV复制以及Ⅰ型干扰素抗病毒作用的影响;研究ISG16对Ⅰ型干扰素信号通路的影响；研究ISG16在经干扰素治疗后有效和无效的丙型肝炎患者外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)中的表达差异。最终阐明ISG16在HCV复制,干扰素抗HCV活性,Ⅰ型干扰素信号通路及HCV逃逸宿主先天免疫中的作用。方法：采用基因克隆方法构建ISG16高表达质粒pcDNA3.1-3×tag-ISG16,转染Huh7.5.1和Con1b细胞,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Realtime-PCR)检测ISG16、HCV以及其他ISGs的表达；采用蛋白质印迹法(Western Blot, WB)检测ISG16蛋白表达和P-STAT1磷酸化水平；采用双荧光报告基因法检测干扰素刺激反应元件(interferon-stimulated response element, ISRE)的活性。以此探讨ISG16对HCV复制、干扰素抗病毒作用以及Ⅰ型干扰素信号通路的影响。抽取经干扰素治疗后的丙型肝炎患者的静脉血,分离得到PBMCs,体外培养经Ⅰ型干扰素(IFN-a)刺激后,检测PBMCs中ISG16的表达水平。结果：构建的ISG16高表达质粒,成功在Huh7.5.1和Con1b细胞中表达；ISG16高表达能够促进HCV复制,抑制IFN-a抗病毒作用,对Ⅰ型干扰素信号通路中的关键点具有明显影响：延长P-STAT1的磷酸化时间,抑制ISRE活性；在丙型肝炎患者PBMCs中,治疗有效和无效之间的本底表达比较发现,治疗无效者本底表达较高,但是由于样本量较少,结果无显著性差异,治疗有效者经IFN-α刺激后,ISG16表达升高更显著。结论：ISG16能够促进HCV复制,抑制IFN-α的抗病毒作用,这种作用可能是通过影响I型干扰素信号通路中的关键点来实现的；丙肝病毒感染后导致ISG16表达升高,也许是HCV逃逸宿主先天免疫关键的分子机制之一。
【关键词】：丙型肝炎病毒 干扰素刺激基因16 Ⅰ型干扰素信号通路 外周血单核细胞
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R512.63
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-9
• 前言9-17
• 1 丙型肝炎病毒研究现状9-12
• 2 干扰素刺激基因1612-13
• 3 本研究的目的与意义13-14
• 4 本研究的技术路线14-17
• 实验材料17-26
• 1 主要实验仪器及耗材17-18
• 2 常用工具酶和试剂18-19
• 3 菌株及培养基19
• 4 细胞及培养基19-20
• 5 转染质粒及载体20-22
• 6 Realtime PCR引物22
• 7 常用试剂配制方法22-24
• 8 主要试剂及来源用途24-26
• 实验方法26-44
• 第一部分 ISG16基因的克隆和表达载体的构建26-33
• 1 ISG16基因目的片段的获得26-29
• 2 目的片段与测序载体连接验证片段正确性29-31
• 3 目的片段与表达载体连接31-33
• 第二部分 重组质粒pcDNA3.1-3×tag-ISG16的真核表达验证33-40
• 1 重组质粒pcDNA3.1-3×tag-ISG16大量提取33-34
• 2 细胞株复苏和培养以及转染体系建立34-36
• 3 重组质粒pcDNA3.1-3×tag-ISG16的真核表达验证36-40
• 第三部分 重组质粒pcDNA3.1-3×tag-ISG16对丙型肝炎病毒以及干扰素信号通路的影响40-42
• 1 ISG16对丙型肝炎病毒复制以及IFN-α抗病毒作用的影响40-41
• 2 ISG16对干扰素信号通路的影响41-42
• 第四部分 ISG16在丙型肝炎病人外周血单核细胞PBMCs中的表达42-44
• 1 丙型肝炎病人外周血标本采集42
• 2 PBMCs的分离42-43
• 3 PBMCs培养和处理43
• 4 总RNA提取和Realtime-PCR检测43-44
• 实验结果44-52
• 1 pcDNA3.1-3×tag-ISG16质粒构建44-46
• 2 pcDNA3.1-3×tag-ISG16在肝癌细胞系中的高表达46-47
• 3 ISG16对HCV复制以及IFN-α抗病毒作用的影响47-48
• 4 ISG16对Ⅰ型干扰素信号通路的影响48-51
• 5 ISG16在慢性丙型肝炎患者PBMCs中的表达水平与干扰素治疗疗效的相关性研究51-52
• 讨论52-55
• 结论55-56
• 附录56-58
• 参考文献58-62
• 文献综述62-73
• 参考文献68-73
• 个人简历73-74
• 致谢74-75

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 Ulrich Spengler;Hans Dieter Nischalke;Jacob Nattermann;Christian P Strassburg;;Between Scylla and Charybdis:The role of the human immune system in the pathogenesis of hepatitis C[J];World Journal of Gastroenterology;2013年44期

中国博士学位论文全文数据库 前2条

1 陈燕妮;微小RNA（miRNA）调控乙型（HBV）和丙型（HCV）肝炎病毒基因表达和复制的分子机制研究[D];武汉大学;2011年

2 徐绍建;PCV2分子流行病学及其感染与JAK-STAT信号通路相互作用研究[D];山东农业大学;2013年

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本文编号：374796