AKT信号通路与HBV感染、复制和抗病毒治疗的关系

发布时间：2017-05-24 23:08

  本文关键词：AKT信号通路与HBV感染、复制和抗病毒治疗的关系，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：全世界约有20亿人曾感染过HBV,其中大部分都是短暂一过性的,但是全球还是有超过3.5亿的人因为没有足够强的免疫反应去清除HBV而得了慢乙肝,每年约有50-100万人死于HBV相关的肝硬化、肝功能代偿不全,肝细胞肝癌等肝脏疾病。虽然病毒的复制是在宿主肝细胞内进行,但是病毒本身并不造成宿主肝细胞的破坏,肝细胞的损伤主要是由于病毒感染后所介导的机体天然性与获得性免疫应答反应造成的。由免疫效应细胞分泌释放的干扰素(IFNs,包括alpha、beta及gamma亚类)即是机体最有效的天然抗病毒的一种机制。目前在临床上应用的人工合成的IFN(包括普通干扰素和长效-干扰素)在接受治疗的且能够耐受的病人中,可以获得30%～40%的转阴率。然而,由于机体各种细胞膜上都有干扰素受体,因此IFN的副作用较大,绝大多数患者都不能耐受。临床上另一类抗病毒药物是核苷类似物(NAs,包括拉米夫定、阿德福韦、替米夫定、恩替卡韦和替诺夫韦),它主要是针对病毒的自我复制过程,通过竞争性的抑制病毒DNA聚合酶、阻碍病毒DNA合成链的延伸,从而影响HBV DNA的复制。因为NAs是通过与内源性的核苷酸竞争,因此NAs药物的治疗通常需要经历长期甚至终身的治疗过程,而且早期的NAs还很容易诱发病毒突变而导致耐药和复发,引起复发的主要原因就是由于其不能有效的清除病毒复制的模板HBV cccDNA。在病毒复制过程中,核苷酸作为病毒复制的原料扮演着重要的角色,而糖代谢的中间产物5-磷酸核糖就是核苷酸合成的原料,由此可知核苷酸的合成与病毒复制能否进行也是受是机体糖代谢的调控的。在糖代谢调控中的一个关键的调控因子便是蛋白激酶B,又叫AKT,AKT能够通过影响葡萄糖转运蛋白(glucose transporter, GLUTs)的表达和质膜转位以及对糖酵解过程中的关键限速酶活性与表达的调节而影响糖代谢的途径和结局,尤其是与核苷酸生物合成关联的磷酸戊糖旁路(Pentose Phosphate Pathway, PPP),后者是产生核苷酸生物合成代谢中间产物核糖—5—磷酸(R—5—P)的关键代谢通路。已有文献报道AKT活性与HBV的体外复制成水平呈负相关,显然这样的相关性与AKT在糖酵解和核苷酸代谢过程(R—5—P)中所起到的作用是矛盾的。为了进一步理清AKT活性与HBV复制及抗病毒治疗的关系,我们设计通过体外细胞水平、HBV携带小鼠动物模型及临床病人的组织样本上来分别探讨AKT活化与HBV感染、复制的关系。并通过AKT抑制剂的使用来观察其抗病毒作用效果,以及AKT抑制剂与核苷类似物药物的相互影响,以期望从病毒复制的源头核苷酸的生物合成上阻断病毒的复制,从而达到从感染肝细胞中彻底清除HBV的作用。结果：1、在肝细胞系L02、HepG2、HepG2.215、Bel、SMMC-7721中筛选AKT-S473表达情况的实验中,转入HBV全基因的HepG2.215细胞AKT-S473的表达较其他细胞株多,而且裸鼠的HBV感染模型以及乙肝病人的肝组织中AKT-S473的表达与正常对照组相比均明显提高。2、在转入pEGFP-CA-AKT 和 pEGFP-NA-AKT质粒的HepG2.215中,利用WB检测到转染pEGFP-CA-AKT质粒能够活化AKT,而转染pEGFP-NA-AKT可有效抑制AKT的活化,ddPCR检测转染质粒后HepG2.215细胞上清中HBV DNA的量,结果显示HBV DNA会随着AKT的活化而增多,随AKT的失活而减少。3、AKT抑制剂AZD5363在剂量浓度为1 μM时HepG2.215细胞中HBV DNA减少了52%,AKT抑制剂AKTil/2剂量达到0.5μM时,HepG2.215细胞中HBV DNA减少了44%,当雷帕霉素靶蛋白C1(mammalian target of rapamycin C1, mTORC1)抑制剂Rapamycin 剂量浓度达到1μM时,HepG2.215细胞中HBV DNA减少了39%。ADZ5363 (1μM)、AKTi1/2 (0.5 μM)和Rapamycin (1 μM)、Tenofovir(O.15μM)联合应用后HepG2.215细胞上清中的HBV DNA量分别减少了88%、89%、62%。所以当抑制剂与核苷类似物联合应用时,其抗HBV的效果都要好于单独使用。而且AKT及mTORC1抑制剂还能够有效减少HepG2.215细胞中HBV基因的翻译自前基因组RNA (pregenomic RNA, pgRNA)和 cccDNA,在予以药物处理9天后,ADZ5363单独使用组、ADZ5363与Tenofovir联合用药组、Rapamycin单独使用组以及Rapamycin与 Tenofovir联合用药组HepG2.215细胞中的HBV pgRNA分别减少了61%、88%、77%、60%；并且药物处理15天后HepG2.215细胞中cccDNA均下降了40%左右。在裸鼠HBV感染动物模型中,也同样证实AKT的抑制剂在体内具有抗病毒的效果,在第三周时各治疗组中鼠血液中的HBV DNA与加药治疗前相比ADZ5363与Tenofovir联合用药组、ADZ5363组与Tenofovir组HBV DNA分别降低了74%、72%和61%,并且在抑制剂治疗一个月后,HBV表面抗原明显降低。结论：1、HBV的感染能够诱导AKT的活化。2、AKT的活化能够促进HBV的复制。3、AKT抑制剂可以抑制HBV的复制,具有较好的抗病毒效果,与抗病毒药物联用时抗病毒效果好于单独使用。AKT还抑制剂可以抑制HBV RNA的转录从而有利于减少HBV cccDNA与HBV DN A复制的模板。
【关键词】：乙型肝炎病毒 AKT AKT抑制剂 cccDNA 抗病毒治疗
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R512.62
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照6-8
• 中文摘要8-12
• 英文摘要12-16
• 前言16-19
• 第一章：ddPCR用于HBV DNA检测方法学的建立19-33
• 引言19
• 1 材料与方法19-23
• 1.1 材料19-21
• 1.2 方法21-23
• 2 结果23-31
• 2.1 数字PCR的精确性和敏感度检验23-25
• 2.2 针对HBV DNA以及HBV cccDNA进行ddPCR检测的引物设计及样本处理25-28
• 2.3 qRT-PCR与ddPCR检测HBV DNA和HBV cccDNA的比较28-31
• 3 讨论31-33
• 第二章：HBV感染与AKT信号通路的活化33-44
• 引言33
• 1 材料与方法33-38
• 1.1 材料33-35
• 1.2 方法35-38
• 2 结果38-42
• 2.1 HBV感染与AKT活化的关系38-39
• 2.2 肝癌细胞中转染HBV质粒验证AKT的活化与HBV有关39-40
• 2.3 建立鼠慢乙肝模型并体内验证HBV感染能够使AKT活化40-41
• 2.4 临床病人HBV病毒载量与AKT酸化41-42
• 3 讨论42-44
• 第三章：AKT活性对HBV病毒复制的影响44-52
• 引言44
• 1 材料与方法44-49
• 1.1 材料44-46
• 1.2 方法46-49
• 2 结果49-51
• 3 讨论51-52
• 第四章：AKT抑制剂抗HBV效果52-68
• 引言52
• 1 材料与方法52-58
• 1.1 材料52-54
• 1.2 方法54-58
• 2 结果58-66
• 2.1 AKT与mTORC1抑制剂的体外抗HBV效果58-64
• 2.2 AKT抑制剂及HBV抗病毒治疗药物的体内治疗效果64-66
• 3 讨论66-68
• 全文总结68-69
• 参考文献69-73
• 文献综述73-81
• 参考文献78-81
• 致谢81-82
• 在读期间发表论文及申请专利项目82

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本文编号：392201