汉防己甲素对伊曲康唑和伏立康唑抗烟曲霉增效活性及其主要机制研究

发布时间：2017-06-02 12:26

  本文关键词：汉防己甲素对伊曲康唑和伏立康唑抗烟曲霉增效活性及其主要机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的探讨汉防己甲素(tetrandrine,TET)对伊曲康唑(itraconazole,ITR)和伏立康唑(voriconazole,VRC)抗烟曲霉有无增效活性及其主要增效机制。方法参照M38-A方案的微量稀释法,以23株烟曲霉临床株为研究对象,测定TET对其的最大非细胞毒性剂量和ITR、VRC单独及联合TET对其的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentrations,MICs);参照M38-A2方案的棋盘微量稀释法,测定ITR或VRC单独及联合TET抗23株烟曲霉临床株活性,结合FICI(fractional inhibitory concentration index)法和ΔE法对其结果进行评价;用时间-杀菌曲线法动态观察TET对ITR或VRC体外抗敏感株AF17和耐药株AF23活性。以烟曲霉构建小鼠系统感染模型,ITR或VRC单独及联合TET治疗后,从生存率和病原学判断其作用效果;用R6G外排法和RT-PCR法分别测定外排泵功能及其相关基因MDR1、MDR2、MDR3、MDR4和ATRF于ITR或VRC单独及联合TET作用后的相对表达量。结果TET抗烟曲霉的最大非细胞毒性剂量为80μg/m L。ITR单独及联合TET对烟曲霉的MIC值范围分别为0.5μg/m L~32μg/m L和0.0625μg/m L~4μg/m L,差异有统计学意义(P0.05);VRC单独及联合TET的MIC值范围分别为0.25μg/m L~2μg/m L和0.03125μg/m L~0.25μg/m L,差异有统计学意义(P0.05);ITR联合TET作用时,ITR的MIC值由0.125~32μg/m L降至0.0625~2μg/m L,TET的MIC值由256~512μg/m L降至8~64μg/m L,FICI和ΔE法评价均表现为协同作用;VRC联合TET作用时,VRC的MIC值由0.125~2μg/m L降至0.03~0.5μg/m L,TET的MIC值由256~512μg/m L降至8~256μg/m L,FICI和ΔE法评价17株菌表现为协同作用,6株菌表现为无关作用;时间杀菌曲线示:不同浓度的ITR或VRC联合TET比其单独作用均降低烟曲霉的细胞活性,并且缩短抑菌作用的时间。ITR或VRC联合TET比其单独作用均可提高小鼠的生存率(P0.05)和降低肾、脑负荷的烟曲霉菌量(P0.05)。TET可减少烟曲霉对R6G的外排;ITR或VRC联合TET比其单独作用的外排泵基因MDR2、MDR3、MDR4和ATRF低表达(P0.05)。结论汉防己甲素在体外及小鼠体内对伊曲康唑和伏立康唑抗烟曲霉有增效活性;其增效活性与其抑制药物外排功能有关,可能与下调外排泵基因MDR2、MDR3、MDR4和ATRF的表达有关。
【关键词】：汉防己甲素 伊曲康唑 伏立康唑 烟曲霉 增效作用 机制
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R756
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-11
• 前言11-20
• 1 烟曲霉感染的流行病学现状11-12
• 2 临床烟曲霉感染的治疗现状12
• 3 烟曲霉对唑类药物耐药机制12-14
• 4 应对唑类抗真菌药物耐药所采取的策略和分析14-16
• 5 汉防己甲素概况及其作为唑类药物增效剂的研究进展16-18
• 6 本研究的内容、创新性及意义18-20
• 第一部分 汉防己甲素对伊曲康唑和伏立康唑抗烟曲霉体外增效活性研究20-42
• （一）以微量稀释法测定最大非细胞毒性剂量汉防己甲素对伊曲康唑和伏立康唑抗烟曲霉活性20-25
• 1 材料20-21
• 1.1 菌株20
• 1.2 药物20
• 1.3 主要试剂20-21
• 1.4 实验仪器与设备21
• 1.5 药物与主要试剂的配制21
• 2 方法21-22
• 2.1 菌株的保存与活化21-22
• 2.2 菌悬液制备22
• 2.3 TET对23株烟曲霉孢子相的最大非细胞毒性剂量测定22
• 2.4 ITR或VRC单独及联合最大非细胞毒性剂量的 TET 抗烟曲霉活性测定22
• 2.5 统计学分析22
• 3 结果22-25
• 3.1 质控标准22
• 3.2 TET对烟曲霉的非细胞毒性剂量22-23
• 3.3 ITR或VRC单独及联合TET抗烟曲霉活性23-25
• （二）以棋盘式微量液基稀释法测定并评价汉防己甲素与伊曲康唑和伏立康唑的体外静态联合抗烟曲霉作用25-33
• 1 材料25-26
• 1.1 菌株25
• 1.2 药物25
• 1.3 主要试剂25
• 1.4 实验仪器与设备25-26
• 1.5 药物与主要试剂的配制26
• 2 方法26-28
• 2.1 菌株的保存与活化26
• 2.2 菌悬液配制26-27
• 2.3 用棋盘法测定TET联合ITR或VRC抗烟曲霉活性27
• 2.4 药物联合作用效果的评价 采用FICI法和ΔE法对棋盘式微量液基稀释法27-28
• 3 结果28-33
• 3.1 质控标准28
• 3.2 棋盘法测定药物对烟曲霉的活性28
• 3.3 药物联合作用效果的评价28-33
• （三）以时间-杀菌曲线法测定并评价汉防己甲素与伊曲康唑和伏立康唑的体外动态联合抗烟曲霉作用33-42
• 1 材料33-34
• 1.1 菌株33
• 1.2 药物33
• 1.3 主要试剂33
• 1.4 实验仪器与设备33-34
• 1.5 药物与主要试剂的配制34
• 2 方法34-35
• 2.1 菌株的保存与活化34
• 2.2 菌悬液制备34-35
• 2.3 时间-杀菌作用体系的制备35
• 2.4 时间-杀菌作用体系的测定35
• 3 结果35-39
• 4 讨论39-41
• 5 小结41-42
• 第二部分 汉防己甲素对伊曲康唑和伏立康唑抗烟曲霉体内增效活性研究42-50
• 1 材料42-43
• 1.1 菌株42
• 1.2 药物42
• 1.3 主要试剂42
• 1.4 实验仪器与设备42-43
• 1.5 药物与主要试剂的配制43
• 2 方法43-44
• 2.1 菌株的保存与活化43
• 2.2 菌悬液配制43
• 2.3 小鼠43
• 2.4 小鼠免疫抑制与系统造模43
• 2.5 分组及给药43-44
• 2.6 疗效评价44
• 3 结果44-48
• 3.1 小鼠生存率44-46
• 3.2 病原学检查46-48
• 4 讨论48-49
• 5 小结49-50
• 第三部分 汉防己甲素对伊曲康唑和伏立康唑抗烟曲霉增效活性机制研究50-66
• （一）采用R6G外排法测定TET对烟曲霉外排泵功能影响50-57
• 1 材料50-51
• 1.1 菌株50
• 1.2 药物50
• 1.3 主要试剂50
• 1.4 实验仪器与设备50-51
• 1.5 药物与主要试剂的配制51
• 2 方法51-53
• 2.1 菌株的保存与活化51
• 2.2 菌悬液配制51-52
• 2.3 罗丹明 6G (R6G) 标准曲线的确立52
• 2.4 烟曲霉细胞对R6G的吸收和外排52-53
• 3 结果53-57
• 3.1 R6G标准曲线的建立53
• 3.2 烟曲霉对R6G的吸收53-54
• 3.3 烟曲霉对R6G的外排54-57
• （二）采用RT-PCR法测定外排泵相关基因药物作用前后的相对表达量57-66
• 1 材料57-58
• 1.1 菌株57
• 1.2 药物57
• 1.3 主要试剂57
• 1.4 实验仪器与设备57-58
• 1.5 药物与主要试剂的配制58
• 2 方法58-62
• 2.1 菌株的保存与活化58
• 2.2 菌悬液配制58
• 2.3 药物处理菌液58-59
• 2.4 菌体RNA提取59
• 2.5 样品RNA纯化59-60
• 2.6 样品RNA质量鉴定60
• 2.7 RNA逆转录合成cDNA60
• 2.8 实时荧光PCR60-61
• 2.9 统计学分析61-62
• 3 结果62-64
• 3.1 外排泵基因的m RNA水平的相对表达量62
• 3.2 药物作用后外排泵基因m RNA水平相对表达量62-64
• 4 讨论64-65
• 5 小结65-66
• 结论66-68
• 缩略词表68-69
• 参考文献69-80
• 附录80-82
• 致谢82

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  本文关键词：汉防己甲素对伊曲康唑和伏立康唑抗烟曲霉增效活性及其主要机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：415332