基于HIV-1 4E10表位分支肽免疫原制剂处方的研究

发布时间：2017-06-04 15:18

  本文关键词：基于HIV-1 4E10表位分支肽免疫原制剂处方的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：开发艾滋病疫苗是全球面临的重要任务和挑战，尽管艾滋病病毒已发现30多年，但由于其多变和多样性，迄今还没有一种针对该病的疫苗能投入使用。人类免疫缺陷病毒（HIV）包膜蛋白gp41近膜外区（MPER）是多种HIV广谱中和抗体（4E10，，2F5，Z13和10E8）的靶点，在HIV疫苗研究中深受关注。 当HIV病毒感染细胞时，MPER会发生一系列的构象变化，短暂暴露出的表位可以被免疫系统识别并产生应答反应，同时该区域也是抗体发挥中和作用的关键部位。尽管与线性多肽共结晶的结果表明，4E10所识别MPER核心表位构象为-helical结构，但通过构象约束模拟含有该表位的各种免疫原均未能诱导出广谱中和抗体，并且到目前MPER构象仍不完全确定。2013年，ZhangLS等人基于HIV2F5和4E10所识别的保守性表位，通过刚性的赖氨酸核心和柔性的6-氨基己酸连接，设计了一种刚柔动态平衡的HIV2F5和4E10四分支肽免疫原（2F5MAP4和4E10MAP4），免疫活性研究和中和评价结果显示4E10MAP4免疫原可以诱发豚鼠血清产生针对HIV BC (73%positive)、C (93%positive)、B(20%positive)和AE (30%positive)亚型假毒的中和活性。Matthew R. Gardner等人在2015年《Nature》报道，eCD4-Ig通过紧密结合HIV表面两个不变的位点，可阻止部分已知HIV毒株感染。这两项研究成果为HIV疫苗研究开辟了一个新的参考方向。 基于4E10MAP4在豚鼠体内可诱导产生针对已知HIV假毒广谱中和活性的研究结果，本论文开展该免疫原临床制剂处方研究。通过溶解介质选择，免疫次数，免疫剂量，佐剂筛选，研究4E10MAP4制剂处方组成和免疫程序；通过评价佐剂吸附，制剂稳定性，研究4E10MAP4制剂处方相关质量标准。论文拟为艾滋病侯选疫苗4E10MAP4制剂的中试生产工艺和临床研究提供必要支持。 依据前期4E10MAP4免疫原的质量研究，本论文以高效液相色谱（HPLC）、质谱（MS）和小分子蛋白电泳（TricineSDS-PAGE）对免疫原纯度和分子量进行质量复检；ELISA方法确认免疫原表位的正确性。为获得4E10-MAP4的最佳免疫效果，选择免疫次数、剂量和佐剂三个有关因素开展相关研究，确定4E10-MAP4最佳免疫条件和制剂处方组成。实验结果证明：1）4E10-MAP4免疫原分子量、纯度和表位正确性均符合质量标准；2）1M醋酸能够完全溶解4E10-MAP4免疫原；3）随着免疫次数增加，在第四次免疫后效价可达104以上；4）氢氧化铝佐剂辅助4E10-MAP4的免疫效果优于MF59；5）中剂量组（50μg/只）优于低剂量和高剂量组（小鼠）。虽然MF59在流感疫苗中具有很强的免疫调节作用，但不能使4E10-MAP4发挥最有效的免疫应答，不过有趣的是MF59在长效免疫中发挥了较明显的优势。豚鼠实验也显示了相同的结果。由以上数据可得：从安全性和有效性选择1M醋酸为4E10-MAP4免疫原的溶解介质，氢氧化铝为制剂处方的组成，小鼠（50μg/只）和豚鼠（100μg/只）皮下四次免疫为最佳免疫条件。 接下来开展制剂处方相关质量标准研究，首先考察了氢氧化铝佐剂pH值、磷酸盐、浓度及作用时间对4E10-MAP4吸附率的影响；其次对制剂有效成分进行检定，包括解离后免疫原抗原性和制剂疫苗效果（动物实验）；最后评价了制剂的稳定性。结果显示：1）佐剂pH值对吸附率没有显著影响，而经0.05M磷酸根处理后的佐剂吸附率可达85%，铝含量仅需1mg，作用时间为2h；2）制剂成品经1M醋酸冷冻4h即可完全解离，Western blotting和ELISA验证了4E10-MAP4免疫原在解离过程中未发生结构和功能的改变，皮下四次免疫小鼠后可产生特异性抗体，效价可达104以上；3）制剂在6±2℃贮存五周后稳定性良好。 综上所述，基于4E10MAP4免疫原在豚鼠体内可诱导产生针对已知HIV假毒广谱中和活性，本论文以4E10-MAP4免疫原为研究对象，研究了制剂处方组成、最佳免疫程序和相关质量标准，为艾滋病侯选疫苗4E10MAP4制剂的中试生产工艺和临床研究提供必要支持。
【关键词】：HIV-1 MPER 分支肽免疫原 免疫活性 制剂处方
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R512.91
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-8
• 缩略词表8-12
• 第一章 绪论12-29
• 第一节 HIV 背景介绍12-19
• 1.1.1 HIV 病毒简介12-13
• 1.1.2 HIV 疫苗研究现状13-15
• 1.1.3 HIV 广谱中和抗体15-19
• 第二节 免疫佐剂19-27
• 1.2.1 免疫佐剂简介19-21
• 1.2.2 免疫佐剂作用机制21-22
• 1.2.3 获批用于人体的佐剂22-27
• 1.2.3.1 铝盐佐剂22-24
• 1.2.3.2 乳化剂 MF5924-26
• 1.2.3.3 单磷酰酯 A-MPL26-27
• 第三节 立题依据及实验方案27-29
• 第二章 制剂处方组成及最佳免疫程序研究29-49
• 第一节 实验材料29-33
• 2.1.1 多肽合成29
• 2.1.2 主要试剂29-30
• 2.1.3 主要仪器30-31
• 2.1.4 试剂配方31-32
• 2.1.5 实验动物32-33
• 第二节 实验方法33-37
• 2.2.1 多肽配制及质量表征33-34
• 2.2.2 MF5 佐剂配制与鉴定34-35
• 2.2.3 动物免疫35
• 2.2.4 动物采血35
• 2.2.5 ELISA 检测35-36
• 2.2.6 抗体分型36
• 2.2.7 统计学处理方法36-37
• 第三节 实验结果与讨论37-48
• 2.3.1 多肽原液溶解介质的选择37-38
• 2.3.2 确定多肽纯度和分子量38-39
• 2.3.3 分子水平验证多肽表位正确性39-40
• 2.3.4 MF59 佐剂质量表征40-41
• 2.3.5 分支肽免疫原免疫原性41-46
• 2.3.6 讨论46-48
• 第四节 小结48-49
• 第三章 制剂处方相关质量标准研究49-63
• 第一节 材料、试剂和仪器49-51
• 3.1.1 多肽合成、试剂和材料49-50
• 3.1.2 试剂配方50
• 3.1.3 主要仪器与设备50-51
• 第二节 实验方法51-54
• 3.2.1 多肽吸附51
• 3.2.2 多肽解离51-52
• 3.2.3 蛋白免疫印迹和 ELISA52-53
• 3.2.4 动物免疫和采血53-54
• 第三节 实验结果54-62
• 3.3.1 临床制剂处方相关质量研究54-57
• 3.3.1.1 原液膜吸附率研究54
• 3.3.1.2 氢氧化铝 pH 值对多肽吸附率影响54-55
• 3.3.1.3 氢氧化铝磷酸盐对多肽吸附率影响55-56
• 3.3.1.4 佐剂浓度研究56-57
• 3.3.1.5 吸附时间对多肽吸附率的影响57
• 3.3.2 制剂成品检定研究57-60
• 3.3.2.1 制剂有效成分解离57-58
• 3.3.2.2 制剂有效成分抗原性检定58-59
• 3.3.2.3 制剂效价测定59-60
• 3.3.3 制剂稳定性研究60-62
• 第四节 小结62-63
• 结论63-64
• 参考文献64-71
• 作者简历71-72
• 致谢72

【共引文献】

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1 隗黎丽;吴华东;熊六凤;;柱状黄杆菌对草鱼TLRs基因表达水平的影响[J];大连海洋大学学报;2013年04期

2 廖萌;严孙杰;;成骨细胞Toll样受体4信号通路研究进展[J];中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志;2013年03期

3 李致宏;马振刚;李晚军;刘军;韩冰;李田;潘国庆;李春峰;周泽扬;;感染家蚕微孢子虫的蚕体血淋巴蛋白质差异表达分析及质谱鉴定[J];蚕业科学;2013年05期

4 余梦辰;李斌;周红;;内毒素识别、内化及清除相关受体的研究进展[J];重庆医学;2013年29期

5 郑衍生;何怡宁;谢智文;韦平;韦天超;磨美兰;;鸡传染性支气管炎病毒诱导的天然免疫应答研究进展[J];动物医学进展;2013年12期

6 刘争辉;韩代书;;模式识别受体介导的天然免疫反应调节获得性免疫的机理[J];中国组织化学与细胞化学杂志;2013年06期

7 赵雪;梁志清;白纪红;林秋香;张茂华;彭名人;;高脂饮食法构建小鼠非酒精性脂肪性肝病模型雌雄TLR4及IL-6表达的差异[J];广东医学;2013年24期

8 黄标通;周新民;龙建平;;Toll样受体基因多态与肿瘤易感性的研究进展[J];癌变.畸变.突变;2014年03期

9 李珉珉;张瑞涛;胡义平;李建军;姜世勃;李晓娟;刘叔文;;HIV进入抑制多肽VIR576可抑制抗原特异性CD4~+T细胞的体外活化:一种潜在的双功能杀微生物剂(英文)[J];南方医科大学学报;2014年05期

10 刘昱;祁文娟;魏丽惠;;HPV预防性疫苗在预防子宫颈癌中的应用进展[J];中国妇产科临床杂志;2013年04期

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1 Wei Long;Jinhang Zan;Zewei Zhou;Xin He;Jin Jin;Saijun Fan;Peixun Liu;;Computational Simulation for Binding Interaction of TLR5 with Flagellin[A];第二届国际计算科学与工程国际学术研讨会论文集[C];2013年

2 董岩;曾明;;痢疾疫苗研究的最新进展[A];2013年中国药学大会暨第十三届中国药师周论文集[C];2013年

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1 杨明;CpG ODN-MF59辅佐肿瘤抗原诱导抗小鼠黑色素瘤及肺癌的实验研究[D];吉林大学;2012年

2 赵一萍;蒙古马免疫相关基因表达研究及脾脏表达谱分析[D];内蒙古农业大学;2013年

3 薛雪;AQP4基因缺失对中脑TGF-β产生的影响及其与帕金森疾病的相关研究[D];南京医科大学;2013年

4 王晶晶;中华绒螯蟹免疫致敏现象及相关分子机制的初步研究[D];中国科学院研究生院（海洋研究所）;2013年

5 王雷雷;扇贝补体相关分子的结构及功能研究[D];中国科学院研究生院（海洋研究所）;2013年

6 赵敏;高脂饮食对大鼠肝脏内质网应激和炎症的影响及低脂膳食干预效果研究[D];华中科技大学;2013年

7 凌彦博;新型HIV-1融合抑制剂的研究与基于多肽六股螺旋的人工模拟酶研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2013年

8 孟佳子;人源HIV-1广谱中和Fab抗体的鉴定[D];北京协和医学院;2013年

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1 梁存军;纳米铝佐剂的制备及辅佐HPAIV H5N1的免疫学研究[D];西南大学;2008年

2 王亚丽;CpG ODN作为重组乳酸乳球菌佐剂对小鼠免疫应答的影响[D];四川农业大学;2012年

3 赵达;鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白对牛金黄色葡萄球菌GapC蛋白的免疫增强作用[D];黑龙江八一农垦大学;2013年

4 徐汉阳;拟南芥EFR与黑腹果蝇SCOT蛋白重组表达、纯化及晶体研究[D];安徽大学;2013年

5 乔红秀;病毒及质粒DNA刺激后小鼠肌细胞内IFN-β与PD-L1的表达情况[D];河北医科大学;2013年

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9 邓玲玲;益生菌代谢产物对TGEV感染IPEC-J2细胞的影响[D];东北农业大学;2013年

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