田鼠巴贝虫病分子调查及其诊断抗原高通量筛选

发布时间：2017-06-26 17:11

  本文关键词：田鼠巴贝虫病分子调查及其诊断抗原高通量筛选，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:对中缅边境地区发热人群田鼠巴贝虫(Babesia microti)感染情况调查及田鼠巴贝虫病相关诊断抗原候选分子高通量筛选鉴定。方法:1)首先对2014年6~8月期间在中缅边境地区收集的200份排除疟疾感染发热病人的全血血样提取DNA,然后应用基于田鼠巴贝虫18srRNA序列与微管蛋白序列设计引物进行巢式PCR扩增和测序分析鉴定田鼠巴贝虫感染情况。2)基于田鼠巴贝虫公共数据库筛选分泌蛋白、重复序列和PiroplasmaDB公开数据库中部分田鼠巴贝虫与恶性疟原虫、牛巴贝虫同源序列筛选构建本地数据库,从田鼠巴贝虫(Babesia microti ATCC#174;PRA-99TM)感染的BALB/c小鼠血液中提取田鼠巴贝虫RNA经反转录为cDNA,以田鼠巴贝虫cDNA为模板扩增目的基因片段。利用无缝克隆技术连接目的基因片段的扩增产物和质粒载体pEU-His,经过重组质粒的鉴定,最后获得含有目的基因片段的表达质粒。利用试剂盒提取重组质粒后,采用麦胚无细胞蛋白表达体系进行表达,用western-blot技术分析鉴定出表达正确的蛋白。通过蛋白芯片技术用不同感染时期鼠血清对表达正确的蛋白进行高通量筛选。结果:1)在200份发热病人巢式PCR检测有2份病人全血经两种巢式PCR和测序分析鉴定为田鼠巴贝虫感染,并经进化序列分析为人兽共患型田鼠巴贝虫株。2)筛选222个目的基因片段构建本地数据库,PCR成功扩增了215个片段,无缝克隆成功构建了186个重组质粒,麦胚无细胞蛋白合成系统成功表达了167个重组蛋白。以感染田鼠巴贝虫的BALB/c小鼠不同时期血清为抗体,利用蛋白芯片技术从167个重组抗原中筛选出10个重组抗原,分别是:BmSP44、BmRS8、BmRS21、BmRS28、BmRS29、BmHP33、BmHP37、BmHP41、BmHP42和BmHP43。结论:在我国云南省中缅边境地区存在可感染人和其他哺乳动物的田鼠巴贝虫;用感染田鼠巴贝虫的BALB/c小鼠不同感染时期血清共筛选出10个重组抗原,但其应用于人田鼠巴贝虫感染的诊断还需进一步验证。
【关键词】：田鼠巴贝虫 巢式PCR 诊断 无缝克隆 麦胚无细胞蛋白合成系统 重复序列
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R531
【目录】：

• 中文摘要4-6
• ABSTRACT6-10
• 引言10-18
• 1.巴贝虫的感染过程12
• 2.巴贝虫病的流行与防治12-13
• 3.巴贝虫病的诊断13-17
• 3.1 病原诊断技术13-14
• 3.2 分子生物学诊断技术14-15
• 3.3 免疫学诊断技术15-17
• 4. 本研究的目的和意义17
• 5. 本研究的主要内容17
• 6. 本研究的技术路线17-18
• 第一部分 云南省中缅边境地区发热病人田鼠巴贝虫感染情况的分子调查18-28
• 1、材料与方法18-22
• 1.1 发热病例的来源18
• 1.2 主要仪器和设备18-19
• 1.3 实验试剂和溶液配方19-20
• 1.4 巢式PCR检测20-22
• 1.5 分子鉴定阳性血样血涂片Giemsa染色观察22
• 1.6 测序结果分析22
• 2、结 果22-26
• 3、讨 论26-28
• 第二部分 田鼠巴贝虫基因的克隆、表达和诊断抗原的高通量筛选28-64
• 1、材料与方法29-47
• 1.1 实验材料来源29
• 1.2 主要仪器和设备29-31
• 1.3 实验试剂和溶液配方31-34
• 1.4 cDNA的制备34-35
• 1.5 PCR引物的设计35-37
• 1.6 载体线性化37-39
• 1.7 目的基因的扩增39-40
• 1.8 无缝克隆40-41
• 1.9 抽提质粒41-42
• 1.10 目的基因的表达42-43
• 1.11 重组蛋白的免疫印迹分析43-45
• 1.12 重组蛋白的高通量筛选45-47
• 2、结果47-62
• 2.1 基因片段筛选47-51
• 2.2 PCR引物的设计51
• 2.3 载体线性化51-52
• 2.4 目的基因的扩增52-54
• 2.5 无缝克隆54-56
• 2.6 免疫印迹（western-blot）鉴定无细胞表达的蛋白56-59
• 2.7 重组蛋白的高通量筛选59-62
• 3、讨 论62-64
• 全文总结64-66
• 参考文献66-72
• 英文缩略词表72-73
• 本研究所获得的基金资助73-74
• 研究成果74-75
• 攻读学位期间其他科研成果75-76
• 致谢76-77
• 附录77-96

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本文编号：486928