公共引物介导的多重PCR技术在细菌性脑膜炎诊断中的应用研究

发布时间：2017-06-28 12:10

  本文关键词：公共引物介导的多重PCR技术在细菌性脑膜炎诊断中的应用研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：第一部分：一种高效筛选公共引物的方法目的：设计一种筛选公共引物的方法。方法：将3条正向引物和3条反向引物序列连接于一段人类β-actin基因序列两端,将连接片段导入pMD19-T载体构建重组质粒,利用此质粒模板进行9对引物的敏感性检测。步骤包括：引物设计、插入序列的选择、酶切转化、质粒提取、敏感性检测。结果：区别9对公共引物的敏感性,筛选出灵敏性较高的公共引物对。结论：该方法操作简单、高效和快速,可用于公共引物的高效筛选。第二部分：筛选检测细菌性脑膜炎的公共引物目的：筛选出一条适用于细菌性脑膜炎检测的多重PCR体系的公共引物。方法：通过特异性比较,挑选出3条公共引物。运用高效筛选公共引物的方法,对3对公共引物进行敏感性检测。结果：UP1、UP2和UP3的特异性均较高,但敏感性分别为10~2,10~6,10~3拷贝。结论：本次实验筛选出的UP1可优先用于多重PCR体系的构建。第三部分：细菌性脑膜炎多重PCR检测体系的设计与鉴定目的：以导致细菌性脑膜炎的常见六种细菌为检测靶标,建立新型具有高通量的“公共引物”介导的多重PCR检测体系,研发适用于临床的细菌性脑膜炎的检测试剂盒。方法：包括三部分：(1)质粒模板的构建：对目的模板和载体双酶切以后连接转化,重组质粒进行菌落PCR和测序鉴定；(2)多重体系的建立：设计特异性引物和嵌合引物；确定扩增体系和反应条件；体系特异性检测；体系敏感性检测；(3)临床标本的检测：提取CSF基因组DNA,用构建的UP-M-PCR体系进行检测。结果：嵌合引物和UP-M-PCR体系扩增靶标序列时无非特异性带产生,S. agalactiae, L. monocytogenes, S. pneumoniae, N. meningitis, H. influenza和S.aureu的多重体系敏感性检测结果分别为10~2,10~3,10,10~2,10~2和10~4拷贝。运用UP-M-PCR体系进行临床标本的检测时,成功检出3例标本。结论：本课题构建的UP-M-PCR检测体系具有较高的特异性和敏感性,可用于检测细菌性脑膜炎病原体的检测,具有临床应用价值。
【关键词】：细菌性脑膜炎 多重PCR 公共引物 引物筛选
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R515.2;R440
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-9
• 研究背景9-14
• 参考文献10-14
• 第一部分 一种高效筛选公共引物的方法14-29
• 材料和方法14-23
• 实验结果23-26
• 讨论26-27
• 参考文献27-29
• 第二部分 筛选检测细菌性脑膜炎的公共引物29-42
• 材料和方法30-36
• 实验结果36-40
• 讨论40
• 参考文献40-42
• 第三部分 细菌性脑膜炎多重PCR检测体系的设计与鉴定42-58
• 材料和方法42-48
• 实验结果48-52
• 讨论52-55
• 参考文献55-58
• 结论58-59
• 综述脑炎常见病原体分析及临床辅助检查方法59-70
• 参考文献67-70
• 攻读学位期间发表的论文、科研成果70-71
• 附录71-73
• 致谢73

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