人源化小鼠模型的构建及人巨细胞病的的监测

发布时间：2017-07-20 19:15

  本文关键词：人源化小鼠模型的构建及人巨细胞病的的监测

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【摘要】：造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation,HSCT)是治疗血液系统疾病如白血病、骨髓增生异常综合症、再生障碍性贫血、淋巴瘤等有效方法之一。经过几十年的发展,HSCT在临床中应用越来越广泛,虽然移植技术及方法都有了很大进步,但HSCT后人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)感染依然是影响患者长期生存的重要因素之一。HCMV感染在中国人群中非常普遍,大约95%的中国人感染过HCMV。HCMV的感染率随着年龄的增加而增多[1],它可以通过唾液、尿液、性接触及血液制品传播[2]。HCMV感染分为原发感染、再发感染和潜伏感染:(1)原发感染:初次感染,即在HCMV血清学阴性患者体内发现HCMV或其产物;(2)再发感染:HCMV血清学阳性患者体内潜伏的病毒再次激活或再次感染不同的外源性HCMV病毒株;(3)潜伏感染:HCMV基因组DNA持续存在于宿主细胞内,任何检测方法都无法检测到病毒产物,但在免疫力低下的时候HCMV被激活,产生新的病毒颗粒。HCMV病指通过活检获得的标本或其他有创操作获得的标本采用敏感性和特异性检查方法检测到HCMV,同时伴有相应器官感染的症状和(或)体征。HCMV病包括:间质性肺炎,视网膜炎,肠炎和其他少见的如出血性膀胱炎和肝炎等[3]。对于免疫系统功能正常的人来讲,HCMV感染后常无任何临床症状,但一旦感染后HCMV即可在体内终身潜伏,潜伏在血液系统的单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞(dendritic cell,DC)及造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)中[4]。在免疫力低下者(如婴幼儿、艾滋病、HSCT、实体器官移植等)无论是HCMV原发感染或再激活,都会产生明显的症状甚至严重的HCMV病。HSCT后HCMV的感染很常见[5,6],尤其是发生急性移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)的患者,其发生HCMV感染的风险更高[7,8]。HCMV血清学阳性的受者移植后100 d内约45%~85%出现HCMV原发感染或再激活感染,在不用抗病毒药物治疗的情况下,这些患者中约有25%~30%将要进展为HCMV终末器官疾病[9]。HCMV肺炎是致命性疾病,病死率高达90%[3],并且发病率也较高,自体HSCT(auto-HSCT)其发病率为1%~6%,异基因HSCT(allo-HSCT)发病率约为10%~30%[5]。HCMV肺炎发生的危险因素包括淋巴细胞减少症、男性及严重的GVHD。HCMV感染对人们的危害已经引起了广泛的关注。目前全球每年共约有13万以上的实体器官移植及HSCT,而HCMV感染是导致患者移植后死亡的重要原因之一。据统计,8%~32%的肾移植患者、39%~41%的肺或心脏移植的患者、22%~29%的肝移植患者、50%胰腺移植患者均受累于HCMV感染[10,11]。HCMV感染也是导致新生儿缺陷最主要的感染性因素[12],且发现HCMV感染与多种癌症的发生有关,如宫颈癌、结直肠癌等,HCMV感染还是心血管疾病发生的共同致病因素[13]。目前hcmv感染机制仍然不完全明确,hcmv的治疗方式主要是化学药物及细胞免疫治疗,但各自都有其局限性。cmv具有高度的种属特异性,即hcmv不能直接感染小鼠,鼠巨细胞病毒(mousecytomegalovirus,mcmv)也不能直接感染人。因hcmv会潜伏到造血干/祖细胞中,所以本试验主要是探索性研究利用粒细胞集落刺激因子(granulocytecolonystimulatingfactor,g-csf)动员的hcmv血清学阳性供者外周血cd34+hsc建立hu-hsc-npgtm(nod.cg-prkdcscidii2rgtm1vst/vst)模型,同时在小鼠的血液、组织器官检测是否发生hcmv的感染,以期为研究hcmv感染机制、治疗提供动物模型平台。本研究主要分为两个部分:首先,实验组小鼠移植前眼眶取血,npg小鼠照射后4~24小时内,骨髓腔注射磁珠分选的cd34+干细胞,观察小鼠的生存状态;移植后的第10d处死一只照射后的小鼠及未照射的小鼠,取出小鼠的股骨,福尔马林液固定,制作病理切片,观察清髓效果;移植后第2周和第4周眼眶采血检测小鼠血象恢复情况;移植后第4、6、8、10、12周用流式细胞仪动态监测小鼠外周血中人cd45+细胞比例。其次,移植后用pcr方法检测小鼠外周血中是否检测到hcmv的dna拷贝数;12周后处死各组小鼠,取出小鼠的肝脏、脾脏及骨髓细胞,检测骨髓、肝脏、脾脏细胞cd45+、cd19+细胞表达及是否存在hcmv的感染;取出小鼠的肺及肠道组织经福尔马林固定,制作组织切片,免疫组化检测肠道及肺脏是否感染hcmv;提取小鼠骨髓细胞dna,运用pcr方法检测骨髓细胞人alu基因的表达情况。通过试验可以得出以下结果:(1)磁珠分选的cd34+干细胞纯度可高达96.3%;(2)npg小鼠照射后骨髓腔内有核细胞及巨核细胞数量均明显减少甚至消失,达到了清髓的效果;(3)实验组小鼠第4周外周血白细胞、血红蛋白及血小板恢复到移植前水平;(4)实验组小鼠在第4、6、8、10、12周均检测到了人cd45+细胞;(5)利用pcr方法检测实验组小鼠人alu基因全部阳性;(6)整个实验过程中实验组小鼠外周血、组织细胞及免疫组化病理切片中均未检测到hcmv。实验结论:骨髓腔注射移植hcmv血清学阳性供者外周血cd34+干细胞至npg小鼠均可以在小鼠体内检测到人cd45+细胞,说明可以建立人鼠嵌合模型;在npg小鼠组织细胞、血液中均未检测到hcmv,说明hcmv血清学阳性cd34+造血干细胞能否使npg小鼠感染hcmv,有待进一步验证。过去人源化小鼠模型大多是以尾静脉注射脐血单个核细胞移植到nod/scid(非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷)小鼠。hcmv感染小鼠模型是将人的hcmv在体外与人胚肺成纤维细胞共培养后通过腹腔注射到小鼠体内,观察其感染情况,虽然此办法可行,但不能研究hcmv潜伏感染-再激活机制及不能为细胞免疫治疗提供动物模型。本实验的创新点在于选择目前国际上最适合做移植、免疫缺陷程度最高的npg小鼠,模拟临床hcmv血清学阳性供者干细胞回输给阴性患者的情况,探索性的研究利用HCMV血清学阳性供者的CD34~+HSC骨髓腔注射给NPG小鼠,观察其在人源化的同时是否可以感染HCMV。
【关键词】：造血干细胞移植 人源化小鼠模型 NPG小鼠 人巨细胞病毒
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R-332;R511
【目录】：

• 缩略词表4-6
• 摘要6-9
• Abstract9-12
• 前言12-16
• 第一部分：人源化小鼠模型的建立16-28
• 实验流程16-17
• 实验材料17-19
• 实验方法19-22
• 实验结果22-26
• 讨论26-28
• 第二部分：小鼠组织细胞中人源细胞及HCMV的检测28-42
• 实验流程28-29
• 实验材料29-31
• 实验方法31-35
• 实验结果35-39
• 讨论39-42
• 结论42-43
• 参考文献43-48
• 个人简历48-49
• 致谢49

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本文编号：569565