hMASP-2对结核性肉芽肿形成的影响及机制的研究

发布时间：2017-07-26 01:09

  本文关键词：hMASP-2对结核性肉芽肿形成的影响及机制的研究

  更多相关文章： hMASP-2 BCG 结核性肉芽肿 重组腺病毒 BALB/c小鼠

【摘要】：背景和目的：结核性肉芽肿是结核病的特征性病理改变,结核病的发生、发展和预后与结核性肉芽肿的形成、成熟及液化的病理进程密切相关。巨噬细胞募集活化、淋巴细胞浸润是肉芽肿形成的主要细胞学基础,细胞因子TNF-α、IFN-γ、 IL-12和CCL2等通过调节巨噬细胞、淋巴细胞而参与肉芽肿的形成过程。淋巴细胞、巨噬细胞和细胞因子与肉芽肿形成的关系虽然有大量报道,但其机制仍不完全清楚。本实验通过研究补体系统凝集素途径关键效应酶MASP-2对结核性肉芽肿形成的影响,并揭示其作用机制,为结核病的免疫治疗提供一个新型的靶点和思路。方法：采用Invitrogen公司的BLOK-iTTM表达系统,用Gateway技术进行体外同源重组,重组质粒转染HEK293A细胞进行包装、扩增和构建hMASP-2重组腺病毒。BALB/c小鼠气管注射结核分枝杆菌(BCG5×107CFU/只)建立肉芽肿模型,实验分为四组：①rrAd-hMASP-2重组腺病毒干预组(BCG+rAd-hMASP-2组)；②rAd腺病毒载体对照组(BCG+rAd组)；③模型对照组(BCG组)；④正常对照组(PBS组)。腺病毒(5×107PFU/只)滴鼻干预三次,感染21天后处死小鼠进行检测：①肺组织苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin Staining, HE)染色,光学显微成像系统采图,Image-Pro Plus 6.0软件计算肉芽肿面积,肺组织齐-尼(Ziehl-Neelsen)抗酸染色；②肺组织匀浆涂布于7H10固体培养基上,37℃恒温培养,18-20天后进行BCG的菌落计数；③实时荧光定量PCR(Fluorescence-based Quantitative Real-time PCR,RT-qPCR)检测hmasp-2、ccl2、 ill2、il8和il6 mRNA相对表达量；④免疫组化(Immunohistochemistry)检测肺肉芽肿组织C4b沉积、CDllb+细胞数和CD3+的细胞数；⑤流式细胞术(Flow Cytometry)检测肺和脾组织中CD3+T细胞、CD3+CD4+T细胞和CD3+CD8+T细胞的数量及比率；⑥免疫酶联吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)检测肺、脾和血中IFN-γ和TNF-a的水平。⑦高剂量BCG (1×108CFU/只)感染小鼠,观察rAd-hMASP-2对BCG感染小鼠生存率的影响。结果：1.经PCR和测序验证重组腺病毒rAd-hMASP-2包装成功,并在HEK293A细胞中进行扩增,滴度为109-1010PFU/ml。2.气管注射BCG (5×107CFU/只)感染BALB/c小鼠,第21天在肺部形成典型的结核性肉芽肿病变,建立了BCG感染结核性肉芽肿的小鼠模型。3.与三个对照组相比,BCG+rAd-hMASP-2组检测到hmasp-2 mRNA的表达；并且与BCG+rAd组(光密度值为0.0022±0.0013)相比,BCG+rAd-hMASP-2组肺组织C4b沉积(光密度值为0.0252±0.0129)的面积明显增高(P=0.003),hMASP-2在小鼠肺组织表达并活化裂解C4。4.BCG+rAd-hMASP-2组小鼠生存率为80%,明显高于BCG+rAd组(生存率为50%),hMASP-2能够大大降低BCG感染小鼠的死亡率。5.与BCG+rAd组相比,BCG+rAd-hMASP-2组肺组织肉芽肿面积百分比(30.2%±17.4%)明显增大(P=0.023)；且BCG+rAd-hMASP-2组小鼠肺部荷菌量(3.3×105+4.5×105 CFU/g)显著减低(P=0.005),hMASP-2促进肉芽肿形成减低小鼠肺部载菌量。6.与BCG+rAd组比较,BCG+rAd-hMASP-2组小鼠肺组织淋巴细胞总数(2.56×105±6.41×104个)明显增多(P=0.038)、CD34T细胞数(1.94×104±1.93×103个)显著升高(P=0.037)、CD3+CD8+T细胞数(2.64×103±1.08×103个)明显升高(P=0.042)、且BCG+rAd-hMASP-2组CD3+细胞数(光密度值为0.063±0.0065)和CDllb+细胞数(光密度值为0.0124±0.0032)显著增高,具有统计学差异(P0.05),hMASP-2促进小鼠肺组织T细胞聚集。7.与BCG+rAd组比较,BCG+rAd-hMASP-2组血清中TNF-α(21.9pg/ml)的含量明显增高(P0.05)；与BCG组相比,肺组织中TNF-α(521.2pg/ml)的含量明显增高(P0.05)。肺组织中IFN-γ(158.1 pg/ml)的含量明显高于PBS对照组(P0.05),hMASP-2很可能促进肺组织免疫细胞分泌TNF-α和IFN-γ。8.与BCG+rAd组相比,BCG+rAd-hMASP-2组il6 mRNA的表达量(1.21)、il12mRNA的表达量(1.86)和c cl2 mRNA的表达(2.07)均上调,而il8 mRNA的表达量(0.57)下调。iMASP-2促进机体分泌IL-6、IL-12和CCL2等细胞因子。结论：1.BALB/c、鼠气管注射5×107 CFU BCG可建立结核性肉芽肿的动物模型。2.重组腺病毒rAd-hMASP-2能够在BCG感染小鼠肺组织表达和活化hMASP-2并裂解补体C4,启动凝集素途径。3hMASP-2能促进BCG感染小鼠肺部肉芽肿的形成、降低BCG感染小鼠肺部荷菌量、提高BCG感染小鼠的生存率。4.MASP-2能够增加肺组织中CD11b+巨噬细胞的数量和促进CCL2、IL-6和IL-12等细胞因子的表达和分泌。表明lMASP-2通过上调趋化因子CCL2,趋化和激活CD11b+巨噬细胞,诱导其分泌TNF-α、IL-6和IL-12等细胞因子,进而促进肺组织肉芽肿的形成、减低肺组织荷菌量、提高小鼠BCG感染生存率。5. hMASP-2能够增加肺组织中CD3+T细胞的数量和促进IFN-γ的分泌,尤其使肺组织中CD3+ CD8+ T细胞亚群数量显著增加,表明hMASP-2能够促进肺组织CD3+CD8+T细胞聚集和活化。在巨噬细胞分泌IL-12参与下,诱导Thl细胞和CTL细胞的免疫应答及促进分泌IFN-γ等细胞因子,进而参与肺组织肉芽肿的形成,增强机体对结核分枝杆菌感染靶细胞的杀伤、减低肺组织荷菌量、提高小鼠BCG感染生存率。
【关键词】：hMASP-2 BCG 结核性肉芽肿 重组腺病毒 BALB/c小鼠
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R52
【目录】：

• 中文摘要3-6
• Abstract6-13
• 前言13-20
• 1. 结核病的免疫病理机制13-14
• 2. 结核病治疗的现状和存在的困难14-16
• 3. MASP-2的结构和功能16-19
• 4. 实验技术路线19-20
• 第一章 rAd-hMASP-2的构建20-32
• 1.1 材料与方法20-25
• 1.1.1 主要仪器设备20
• 1.1.2 主要试剂用品20-21
• 1.1.3 方法21-25
• 1.2 结果25-30
• 1.2.1 hMASP-2目的基因的PCR扩增25
• 1.2.2 pYr-ads-4-hMASP-2质粒的双酶切鉴定25-26
• 1.2.3 pYr-ads-4-MASP-2质粒的测序验证26-28
• 1.2.4 pAd-4-hMASP2的XbaI单酶切鉴定28
• 1.2.5 pAd-4-hMASP2质粒测序验证28
• 1.2.6 重组腺病毒的PCR验证28-29
• 1.2.7 rAd-hMASP2的扩增和滴度的检测29-30
• 1.3 讨论30-31
• 1.4 小结31-32
• 第二章 BCG感染结核性肉芽肿形成小鼠模型的建立32-42
• 2.1 材料与方法32-37
• 2.1.1 主要仪器和设备32
• 2.1.2 主要试剂用品32
• 2.1.3 方法32-37
• 2.2 结果37-40
• 2.2.1 BCG扩增培养后浓度测定37
• 2.2.2 不同时间点各组小鼠肺组织荷菌量比较37-38
• 2.2.3 不同时间点小鼠肺组织肉芽肿面积变化38
• 2.2.4 第3周各组小鼠肺组织荷菌量比较38-39
• 2.2.5 第3周各组小鼠肺组织病理和肉芽肿面积比较39-40
• 2.3 讨论40-41
• 2.4 小结41-42
• 第三章 hMASP-2在小鼠体内表达及其活性的检测42-49
• 3.1 材料与方法42-46
• 3.1.1 主要仪器设备42
• 3.1.2 主要试剂用品42
• 3.1.3 方法42-46
• 3.2 结果46-48
• 3.2.1 hMASP-2在小鼠肺组织的表达46
• 3.2.2 hMASP-2的裂解C4活性检测46-48
• 3.3 讨论48
• 3.4 小结48-49
• 第四章 hMASP-2对结核性肉芽肿小鼠生存率的影响49-53
• 4.1 材料与方法49-50
• 4.1.1 实验动物49
• 4.1.2 菌株49
• 4.1.3 其他49
• 4.1.4 方法49-50
• 4.2 结果50-51
• 4.3 讨论51-52
• 4.4 小结52-53
• 第五章 hMASP-2对结核性肉芽肿病理损伤的影响53-61
• 5.1 材料与方法53-55
• 5.1.1 主要仪器设备53
• 5.1.2 主要试剂用品53
• 5.1.3 方法53-55
• 5.2 结果55-59
• 5.2.1 小鼠肺组织肉眼形态55-56
• 5.2.2 小鼠肺组织的病理变化56-58
• 5.2.3 小鼠肺组织细菌载量比较58-59
• 5.3 讨论59-60
• 5.4 小结60-61
• 第六章 hMASP-2对小鼠肺结核肉芽组织巨噬细胞的影响61-72
• 6.1 材料与方法61-64
• 6.1.1 主要设备仪器61
• 6.1.2 主要试剂用品61
• 6.1.3 方法61-64
• 6.2 结果64-69
• 6.2.1 免疫组化检测CD11b~+巨噬细胞64-66
• 6.2.2 ELISA检测TNF-α分泌水平66-67
• 6.2.3 RT-qPCR检测小鼠ccl2、il6、il8和il12 mRNA的相对表达量67-69
• 6.3 讨论69-71
• 6.4 小结71-72
• 第七章 hMASP-2对小鼠肺结核肉芽肿组织T细胞的影响72-86
• 7.1 材料与方法72-76
• 7.1.1 主要仪器和设备72
• 7.1.2 主要试剂用品72
• 7.1.3 方法72-76
• 7.2 结果76-84
• 7.2.1 免疫组化检测CD3~+T细胞76-77
• 7.2.2 流式细胞仪检测T细胞及亚群的数量和百分比77-83
• 7.2.3 ELISA检测IFN-γ的水平83-84
• 7.3 讨论84-85
• 7.4 小结85-86
• 结论86-87
• 总结与展望87-89
• 参考文献89-98
• 在学期间的研究成果98-99
• 缩略语表99-101
• 致谢101

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本文编号：574082