兽用抗菌药物耐药性研究概况

  本文关键词：大肠杆菌对兽医临床抗菌药物耐药情况分析，由笔耕文化传播整理发布。

兽用抗菌药物耐药性研究概况 首席医学网      2006年04月19日 00:07:45 Wednesday  

作者：陈杖榴，吴聪明，蒋红霞，廖晓萍，魏秀丽，丁焕中，曾振灵

【关键词】  兽用

　　1  前言   

　　现代的兽医临床与畜禽、水产养殖业均与抗菌药物有密切的关系。1935年人工合成抗菌药磺胺和1940年应用于医学临床的青霉素，到二十世纪40年代中期已在兽医临床开始使用，1946年Moore等已报道磺胺、链霉素添加于饲料中有促生长作用。至50年代初，在欧、美等发达国家，青霉素、磺胺、链霉素、金霉素等已作为促生长添加剂用于牛、猪和鸡的饲料。以后随着许多新抗菌药的出现，除了兽医临床使用抗菌药物防治畜禽疾病外，还大量使用抗菌药作为饲料添加剂，以提高饲料报酬，增加经济效益。据Kummerer（2001）等报道，欧盟和美国每年抗菌药的消费量都在10000吨左右，其中欧盟约50％、美国超过80％以上的抗菌药用于兽医和畜牧业生产；在欧盟消费的兽用抗菌药中，约3500吨作为化学治疗药物，1500吨作为抗菌促生长添加剂。
   
　　我国大量使用抗菌药物在畜牧业生产是在80年代以后，随着现代集约化养鸡业、养猪业、水产养殖业的发展，必然要用抗菌药以控制各种感染性疾病，并且用大量抗菌药作为促生长添加剂以提高经济效益。由于我国在兽用药物的生产管理上还很不规范，造成抗菌药的滥用、不合理应用的现象十分普遍；与人医"争药"的现象也很严重，如罗红霉素、丁胺卡那霉素刚开始用于人医临床，有的省就批准用于兽用。又如氟喹诺酮类药物是人医临床的主要抗感染药，也很快批准在兽医临床使用，如环丙沙星、氧氟沙星等。我国在畜禽养殖业（包括水产）究竟使用多少抗菌药，缺乏统计资料，作为世界肉、蛋的第一生产大国，使用量应不在欧、美之下，据非正式报道，90年代初仅喹乙醇的产量就达7000吨以上。目前，我国有兽药厂2000多家，年产值约150亿元，还有兽药经营单位5万多家，年销售额约170亿元，估计抗菌药占60～70％，即年消费约为190～220亿元。
   
　　大量使用抗菌药的结果，必然产生耐药性，为了较好的了解我国目前抗菌药耐药性的现状，并探讨动物源细菌耐药性向人病原菌传递的可能性，我们研究室近年来做了一些调查和试验工作，这里作个简要报告。

　　2  对兽用抗菌药物耐药性的研究

　　2.1  广东地区大肠杆菌耐药性调查  我们调查了广东不同地区的3个养猪场、1个养场鸡、1个奶牛场、1个屠宰场和广州市各区的代表性超市。猪、鸡、奶牛、饲养员、学生志愿者、市场鲜肉、加工熟肉等采集样本284份，分离大肠杆菌共1524株。采用WHO推荐的纸片扩散法，按美国临床实验标准化委员会（NCCLS）的判定标准，测定了这些菌株对21种抗菌药的耐药性，分析、比较不同来源大肠杆菌对抗菌药的耐药率及多重耐药情况，结果见表1。

　　表1  不同来源大肠杆菌对21种抗菌药物的耐药率（略）
   
　　调查结果表明，从不同养殖场动物分离的大肠杆菌对21种抗菌药普遍存在耐药性，其中耐药率最高的为青霉素类、四环素类和磺胺药，对头孢菌素、阿米卡星、多粘菌素B的耐药率最低；对氟喹诺酮类的耐药菌较为普遍，其中鸡源大肠杆菌的耐药率为40％，猪源耐药率约25％，牛源仅3.5％，三种动物存在显著差异，这与动物用药的强度、频率呈正相关，鸡用药多，选择压力大，耐药率高，奶牛用药少，耐药率低。相同养殖场内的动物、环境和饲养员分离的大肠杆菌对21种抗菌药的耐药率存在一定的差异，但总的耐药趋势分布相似，尤其从动物和环境分离的菌株，其耐药率比较接近。这种现象表明，在同一养殖场内，动物、环境和饲养员之间可能存在耐药菌的相互传递，或者大肠杆菌处于相同的药物选择压力下，筛选出相似耐药谱菌株。
   
　　另外，从肉类分离的大肠杆菌对多数抗菌药物的耐药率以禽肉分离菌最高，猪肉分离菌次之，牛肉分离菌最低，卤肉、烤肉分离的大肠杆菌也有相当比例的耐药菌，表明养殖场内食品动物的耐药菌在动物屠宰加工过程中可污染肉食品，可能经食物链传递给人类。

　　2.2  大肠杆菌I型整合子／耐药基因盒的分子流行病学调查  细菌基因盒－整合子系统（gene cassette-integron system）是20世纪90年代新发现的可移动的基因元件（Hall, 1991）。以上述分离的大肠杆菌耐药菌株为标本，，用常规PCR方法扩增整合酶基因对I型整合子流行情况进行了调查，并以TD－PCR扩增、同源性酶谱分析及直接测序相结合的方法调查整合子插入耐药基因盒的种类，研究猪场大肠杆菌I型整合子／耐药基因盒的分子流行病学。结果表明，猪场大肠杆菌I型整合子流行较普遍，192株分离菌中有105株携带I型整合子，检出率为54.7%，I型整合子多数位于质粒上；猪场大肠杆菌存在6种I型整合子流行，其中整合二氢叶酸还原酶（dhfr）和氨基糖腺苷转移酶（aadA2）两种耐药基因的I型整合子流行最普遍，检出率达36.6％。从不同来源分离的大肠杆菌，发现以小猪群分离菌的I型整合子检出率最高，饲养员最低。比较还发现，菌株携带整合子及耐药基因盒的情况与其耐药谱及多重耐药表型有密切关系，敏感菌、单耐药及二耐药菌株几乎不存在I型整合子和耐药基因盒，而耐受3种抗菌药物以上的多重耐药菌株，I型整合子和耐药基因盒检出率显著提高，提示I型整合子可能与细菌的多重耐药有关（吴聪明，2003）。

　　2.3  耐氟喹诺酮类大肠杆菌gyrA基因突变研究  从患有大肠杆菌病的动物分离大肠杆菌，并对其进行生化鉴定。按常规方法测定其对恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、麻保沙星的MIC，筛选出5株MIC为4～128mg/l的耐药菌株（其中猪源2株、鸡2株、犬1株）。同时，用亚MIC连续递增法传代培养获得禽大肠杆菌（O78）和猫大肠杆菌对恩诺沙星的高度耐药菌各1株（MIC分别为64mg/l和8mg/l）。从7株耐药菌提取DNA，经PCR扩增并分别进行测序，将测序结果与文献发表的大肠杆菌敏感株的gyrA基因的相应区域进行同源性分析。结果表明，各菌株均在第83位和87位的氨基酸上发生了突变，同源性都是98.3%，其中犬源耐药菌的突变为Ser83→Leu, Asp87→Tyr; 其余6株耐药菌的突变均为Ser83→Leu, Asp87→Asn。这两个突变位点与文献报道的耐药决定区的突变相同，预示gyrA基因Ser83和Asp87突变可能参与构成大肠杆菌对氟喹诺酮类的耐药机制（廖晓萍，2002）。

　　2.4  耐氟喹诺酮类鸡毒支原体gyrA的基因突变研究  对临床分离的3株鸡毒支原体（FL、HS1和HS2）和实验室经恩诺沙星和环丙沙星诱导的2株支原体（S6－10和F14－8）对6种氟喹诺酮类药物恩诺沙星、环丙沙星、达氟沙星、沙拉沙星、氧氟沙星和麻保沙星测定其MIC，均表现不同程度的耐药，其MIC范围为2～32μg/ml。对上述菌株提取DNA，经酶切鉴定和质粒PCR鉴定，确认转化子含有gyrA基因目的片段后，进行测序并用DNASIS分析软件对测序结果进行分析。结果显示，临床分离的3株鸡毒支原体中，1株在gyrA亚基QRDR未发生任何取代，2株则在第83位有一相同的氨基酸取代（Ser83→Ile），其中1株还发生第87位取代（Glu87→Gly），诱导的2株耐药菌，S6－10株在恩诺沙星药物压力下获得的耐药株最常见的突变位点是gyrA第83位（Ser83→Ile），高水平耐药株在第82位增加1个氨基酸取代位点（Asp82→Gly），但在第87位不发生任何取代；而S6-10株在环丙沙星药物压力下获得的耐药株首先在第87位发生突变（Glu87→Gln/Gly），高水平耐药株在第83位增加1个突变位点（Ser83→Ile）。F14－8株在两种药物压力诱导下产生的耐药株最常见的突变位点是gyrA第87位（Glu87→Gln/Gly），高水平耐药侏在第83位增加1个氨基酸取代位点（Ser83→Ile）。在发现上述耐药株突变位点的同时，对部分较低水平耐药的菌株却未发现gyrA的任何位点突变，暗示可能存在其他突变位点或耐药机制，尚待进一步研究（蒋红霞，2002）。

　　2.5  耐氟喹诺酮类猪源沙门氏菌gyrA基因突变研究  从广东某猪场分离3株高水平耐氟喹诺酮类药物的沙门氏菌(MIC764μg/ml)，通过PCR方法扩增gyrA基因片段，然后进行克隆测序。结果表明，3株沙门氏菌均发生Ser83(TCC) →Phe(TTC)及Asp87(GAC) →Asn(AAC)突变，其中1株还发生了His78（CAT）→Tyr(TAT)的突变，国内外尚未见报道，这一突变位点对耐药性的意义，有待进一步的研究。由此可见，高度耐药的猪霍乱沙门氏菌的gyrA基因可发生双位点突变，个别菌株还可能发生3位点突变。由于测定的菌株不多，上述结果尚待进一步重复验证。

　　3   对兽用抗菌药物耐药性几个问题的讨论

　　3.1  我国兽用抗菌药物耐药性的现状  抗菌药在养殖业的大量使用，随之而来的是抗菌药耐药性不断产生并越来越严重。国内对兽医领域抗菌药的耐药性缺乏有计划和系统的监测，所以，对我国兽用抗菌药的耐药性情况很难做出准确的评价。但总的来说，由于抗菌药的滥用和不合理应用十分普遍，故耐药性是相当严重的。许多临床工作者反映抗菌药的效果比以前差，用药剂量不断加大，例如恩诺沙星在1994年刚在我国上市时，治疗鸡的消化系统和呼吸系统疾病一般用25～50ppm饮水，效果相当好，现在用到100ppm效果也不好，有人甚至已用200ppm，这虽然是临床工作者的反映，但也从一个侧面反映了耐药性的严重。本研究调查的结果也足以说明我国兽用抗菌药耐药性的严重性（见表1）。另外，近年来关于抗菌药的耐药性也有一些监测报告，如雷连成对兽医院临床病例和养殖场患病动物分离的146株大肠杆菌对17种抗菌药的耐药率，发现所有的菌株都有不同程度的耐药性，最少耐药3种，最多耐药15种，平均达7种。
   
　　王铭杰等对465株病原菌（主要为大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌）进行了对16种抗菌药的药敏试验，结果377株革兰氏阴性菌对多粘菌素的耐药率为15%，对氟喹诺酮类的耐药率平均为32～38%，对庆大霉素为47%，对喹乙醇为47%；其中大肠杆菌对氟喹诺酮类的耐药率达71～73%。赵静等从北京某猪场发生腹泻仔猪分离的115株大肠杆菌，对其进行了耐药性监测，发现受检菌株全部对2种以上抗菌药有耐药性，其中耐2～4种药物有53株（46.6%）。上述几个报道虽然总的菌株数较少，不能全面代表兽用抗菌药现状，但也足于说明耐药性问题的严重性。

　　3.2  兽用抗菌药物耐药性与人类健康  二十世纪50年代至70年代被人们称为抗生素的黄金时代，许多抗生素相继被发现并用于临床，对细菌感染性疾病可以说是"药到病除"，但人们却忽视了如影随形的耐药性问题，上世纪80年代以后，由于抗菌药的广泛应用和不合理应用，细菌对抗菌药的耐药性已成为一个世界性的医学难题，从而引起了WHO和世界各国政府的严重关注。细菌耐药性的普遍存在与抗菌药的选择压力有直接的关系是肯定无疑的，但是细菌耐药性与畜牧养殖业和兽医临床大量使用抗菌药是否有关，却是一直存在争论的问题。不过近年来许多科学工作者的研究报告，已逐步证明，动物应用抗菌药与耐药性增加有着密切的关系。1997年10月WHO在柏林召开的《关于抗生素应用于食品动物对人类医疗的影响》专家研讨会上，与会者一致认为，使用抗菌药物会导致细菌产生耐药性，并且存在耐药沙门氏菌、大肠杆菌、弯曲杆菌通过食品传递到人从而给人的健康带来潜在威胁的可能性。
   
　　雷连成报道，动物源大肠杆菌的耐药谱普遍比人源大肠杆菌的耐药谱广泛，而且耐药强度也比人源大肠杆菌强。这一现象说明，由于兽医临床大剂量、大范围、种类无限制使用抗菌药，导致动物源性病原菌耐药现象异常严重；另一方面说明来自动物的病原耐药问题比人源性病原的耐药更严重，已构成对人类健康的威胁。

　　3.3  动物源细菌耐药性的扩散与传递  从上述我们对大肠杆菌耐药性的调查结果，各类养殖场动物、环境和饲养员分离的大肠杆菌耐药性趋势分存均很相似，而且三种来源的大肠杆菌之间还存在不少相同耐药谱的多耐药菌株，尤其是动物源及环境源的分离菌更为接近，这表明耐药菌在动物、环境和饲养员之间可能存在扩散、传递现象。虽然许多现象表明耐药菌株的耐药因子可以通过某种机制传递给人类病原菌，但动物源细菌耐药性可否向人类病原菌传递的问题一直存在着争论。据Hunter报道，从应用安普霉素（apramycin）多年的猪场的仔猪粪便，周围环境和牧场主的粪便中均分离到耐安普霉素的大肠杆菌，这些耐药菌株中都含有一个相似的大约为62kb的耐药质粒，而且这些质粒可以互相传递。国内这方面的研究报道很少，只有胡子鉴曾通过大肠杆菌耐药谱调查和脉冲场凝胶电泳比较相同或相似耐药谱之间的亲缘关系，结果发现同一养殖场不同动物个体及饲养员相同或相近耐药谱的菌株，其脉冲场凝胶电泳指纹相似，因此认为同处一环境对氟喹诺酮类耐药的大肠杆菌可能由克隆传播造成的。
   
　　关于细菌耐药性的扩散机制和方式，国际上已经作了非常广泛深入的研究，细菌除通过基因突变获得耐药性外，还可通过携带可转移遗传因子包括质粒、转座子和噬菌体等使耐药性扩散传播。20世纪90年代又发现了细菌耐药性的整合子/基因盒系统（Hall，1991），根据我们的调查，猪场分离的大肠杆菌I型整合子及耐药基因盒检出率达54.7％，而且携带两个整合子的现象较普遍，占整盒子检出率的15.2%，由于整盒子潜在的基因捕获及整合表达能力，将来可能会更广泛流行，尤其是在药物选择压力持续作用下，这种可能性更大，对细菌耐药性的传播可能是一种严重的威胁。

　　3.4  兽用抗菌药耐药性的监控措施  严重的细菌耐药性形势已引起WHO等国际组织和各国政府的重视和关切，我国的人医领域从80年代已开始对抗菌药耐药性进行监测，但我国兽医领域抗菌药的耐药性至今尚未引起国家有关部门的高度重视。关于兽用抗菌药物耐药性的监控措施，徐士新等已有专门文章提出许多很好的建议和意见值得参考。根据我国目前的情况，我们认为应该采取如下几个方面措施，有效的控制抗菌药耐药性的扩散，以保证动物和人类的健康。

　　3.4.1  开展动物源细菌耐药性监测  农业部或有关部门要建立专门机构或专门立项，立即开展动物源抗菌药耐药性全面、系统的监测工作，以统一的方法和标准在全国开展耐药性调查，掌握我国目前抗菌药耐药性的流行情况，提供系统的耐药性流行资料，有利于有关机构制定抗菌药管理的政策和措施，为临床合理使用抗菌药提供科学依据。

　　3.4.2  对兽用抗菌药物实施严格管理  我国兽医领域没有实施处方药与非处方药制度，是造成抗菌药滥用和不合理应用以致耐药性严重流行的重要原因。因此，今后必须把抗菌药列入处方药的规范管理，只有兽医师才有权使用抗菌药并保证合理应用。有人建议，耐药率超过70%的抗菌药应停止使用。必须合理用药，减少亚治疗浓度的预防性用药，严格控制一般抗菌药用作促生长添加剂。

　　3.4.3  严格控制人兽共用抗菌药的应用  目前，我国兽用抗菌药与人用医疗药物没有严格区分，有的人把刚上市的人用新药转到兽医临床使用，这是产生耐药性传递的一个重要途径，所以，各级管理部门要严格把关，不能随便批准人用抗菌药转为兽用，已批准的认为不合适的应该撤消，例如前面提到的罗红霉素、阿米卡星等，氟喹诺酮类药已有兽医专用品种，建议人用品种不再作兽用，如环丙沙星、氧氟沙星等。

　　3.4.4  对养殖人员加强宣传和培训工作  我国的畜、禽、水产养殖业发展很快，但从业人员素质不高，对如何科学、合理使用抗菌药缺乏应有的知识。另外，对抗菌耐药性的的严重性和危害性也不了解。因此加强宣传教育和培训工作，从源头上减少耐药性产生的条件，是一项十分重要的工作。

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　　（华南农业大学兽医学院， 广州    510642）

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