仔猪大肠杆菌和C型产气荚膜梭菌

发布时间：2015-03-03 18:18

刘泽文1，袁芳艳1，田永祥1，周丹娜1，杨克礼1，段正赢1，，郭  锐1，罗碧毅2
（1.湖北省农业科学院畜牧兽医研究所/动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室，武汉  430064；2.湖北省京山县动物疫病预防控制中心，湖北 京山  431800）

 

摘要：为了确定不同纤毛抗原的猪大肠杆菌和C型产气荚膜梭菌引起试验动物发病的最小菌（毒）含量，用不同菌数的E.coli C83549（K88）、C83644（K99）和C83710（987P）菌株培养物对出生18～24 h的仔猪进行攻毒，用不同毒素含量的C型产气荚膜梭菌毒素分别对出生18～24 h的仔猪和家兔进行攻毒。结果表明，引起仔猪发病的大肠杆菌三种菌株的最低含量均为150×108 CFU，C型产气荚膜梭菌引起1日龄仔猪和家兔发病的最低毒素含量分别75和80小鼠MLD。
关键词：大肠杆菌；C型产气荚膜梭菌；毒力试验
中图分类号：Ｓ852.7                  文献标识码：Ａ                 文章编号：1007－273X（２０１３）０3-0029-03仔猪红痢和黄痢是新生仔猪最常见的两种传染病，主要发生于出生后1周内的新生仔猪，发病急、死亡快，常常给养猪业造成非常巨大的经济损失［1］。
    仔猪黄痢主要是由致病性大肠杆菌（EPEC）引起发病， EPEC不侵入上皮细胞，而是利用一种或多种菌毛粘附因子，如F4（K88）、F5（K99）、F6（987P）或F41和F42吸附在新生仔猪小肠黏膜上繁殖并产生肠毒素。该病常发生于出生后1周以内的仔猪，以1～3日龄最常见，7日龄以上很少发生，同窝仔猪发病率可达到90%以上，死亡率极高，甚至全窝死亡，给养猪生产带来极大的危害。仔猪红痢是由C型产气荚膜梭菌引起的，该菌为革兰氏阳性有荚膜不运动的厌氧大杆菌，可产生致死毒素，引起仔猪的肠毒血症，坏死性肠炎。该病主要侵害出生后3 d以内仔猪，病程短促，有些在生后3 d内全窝死亡，最急的临床症状多不明显，一发现症状即迅速死亡，发病率可达40%～50%，病死率可高达100%［2］。
    国内外对于仔猪红痢和黄痢的主要预防措施是进行免疫接种。目前用于预防这两种疾病的疫苗有仔猪红痢氢氧化铝胶灭活疫苗及大肠杆菌病油乳剂灭活疫苗和基因工程苗，这些疫苗均为单联疫苗或多价苗，在实际应用过程中受到很大限制，鉴于此，本研究室开展了新生仔猪大肠杆菌病和C型产气荚膜梭菌病二联灭活疫苗的研究。在二联疫苗效力试验中，为了准确掌握动物的攻毒剂量，保证疫苗的免疫效果，开展了仔猪大肠杆菌和C型产气荚膜梭菌对仔猪的毒力以及C型产气荚膜梭菌对家兔的毒力研究，现报告如下。
1  材料和方法
1.1  菌种
   大肠杆菌制造和检验用菌种为大肠杆菌C83549（K88）、C83644（K99）、C83710（987P）菌株；C型产气荚膜梭菌制造和检验用菌种为C59-2菌株，均由中国兽医药品监察所鉴定、保管和供应。
1.2  试验动物
1.2.1  初生仔猪  经间接血凝试验检测其血清大肠杆菌K88、K99、987P纤毛抗体效价均不高于1∶8，经血清中和试验检测C型产气荚膜梭菌毒素抗体阴性的未免疫健康初胎怀孕母猪所产18～24 h仔猪，由武汉金鹰牧业有限公司提供。
1.2.2  家兔  1.5～2.0 kg健康家兔购自武汉市万千佳禾实验动物养殖场。
1.3  大肠杆菌攻毒菌液的制备
   按3%～5%的接种剂量将大肠杆菌C83549（K88）、C83644（K99）、C83710（987P）菌株接种Minca汤培养基，在36～37 ℃条件下培养7 h，收获菌液，细菌计数。调整细菌浓度为100×108 CFU/mL。1.4  C型产气荚膜梭菌攻毒毒素的制备
将C型产气荚膜梭菌C59-2菌株按1%～2%接种厌气肉肝汤，培养16～18 h，收集菌液，离心，取上清，测定毒素液对小白鼠最小致死量（MLD）。调整毒素含量为100 MLD/mL。
1.5  大肠杆菌对仔猪的毒力测定
   分别用100×108 CFU、150×108 CFU、200×108 CFU、250×108 CFU的大肠杆菌C83549（K88）、C83644（K99）、C83710（987P）口服攻毒出生18～24 h的仔猪5头，根据每组仔猪发病（腹泻和死亡）情况，确定各血清型大肠杆菌引起仔猪发病的最小的菌数含量。
1.6  C型产气荚膜梭菌毒素的毒力试验
1.6.1  C型产气荚膜梭菌对家兔毒力试验  分别用60 MLD、65 MLD、70 MLD、75 MLD、80 MLD和85 MLD 静脉注射1.5～2.0 kg家兔5只，观察24 h家兔的死亡情况，确定毒素对家兔的最小发病剂量。
1.6.2  C型产气荚膜梭菌对仔猪毒力试验  分别用60 MLD、65 MLD、70 MLD、75 MLD、80 MLD和85 MLD 静脉注射 18～24 h仔猪5头，观察24 h仔猪的死亡情况，确定引起仔猪死亡的最小梭菌毒素含量。
2 结果与分析
2.1 大肠杆菌对仔猪的毒力测定结果
    用不同菌数的大肠杆菌C83549（K88）、C83644（K99）、C83710（987P）培养物分别口服攻毒出生18～24 h仔猪，结果（表1）显示每头仔猪经口灌服150×108CFU大肠杆菌，可引起仔猪100%发病，确定150×108CFU为大肠杆菌引起仔猪发病的最小剂量。

2.2  C型产气荚膜梭菌毒素的毒力试验结果
2.2.1  C型产气荚膜梭菌对家兔毒力试验结果  用不同剂量（小鼠MLD）的C型产气荚膜梭菌毒素静脉注射体重为1.5～2.0 kg健康家兔，每只注射80倍MLD可引起家兔100%死亡，确定C型产气荚膜梭菌引起家兔发病死亡的最小毒素含量为80倍MLD（表2）。

2.2.2  C型产气荚膜梭菌对仔猪毒力试验结果  用不同剂量（MLD）的C型产气荚膜梭菌毒素静脉注射出生18～24 h内的新生仔猪，每头注射75倍MLD可引起仔猪100%死亡，确定C型产气荚膜梭菌引起仔猪发病死亡的最小毒素含量为75倍MLD。

3 小结与讨论
   （1）新生仔猪红痢（大肠杆菌病）和黄痢（产气荚膜梭菌病）是新生仔猪最常见的两种肠道传染病，主要引起出生后1周内的新生仔猪腹泻，由于发病急、死亡快，给养猪业造成很大的经济损失。因此为了防止该病的发生，最好的办法是制备疫苗对母猪进行免疫接种，初生仔猪通过吸吮母乳来获得被动免疫［3］。我们用含K88、K99、987P纤毛抗原的大肠杆菌和C型产气荚膜梭菌分别接种于适宜培养基培养、制备了仔猪大肠杆菌病、C型产气荚膜梭菌病二联灭活疫苗，为了检验疫苗的效果，需要对动物进行免疫攻毒试验，掌握好攻毒的剂量是影响疫苗效力的关键，因此，本研究对猪大肠杆菌和C型产气荚膜梭菌的毒力开展了研究，由于疫苗的效力检验中涉及用家兔替代本动物做效力检验，因此也进行了C型产气荚膜梭菌毒素对家兔的毒力试验。
    （2）大肠杆菌不同纤毛抗原菌株对18~24 h初生仔猪具有较强的致病性，其致病性的强弱与感染菌数有很大关系，研究结果表明，150×108 CFU的大肠杆菌K88、K99、987P菌株均可引起仔猪100%发病。C型产气荚膜梭菌可引发仔猪红痢，该型菌的主要致病毒素是α和β外毒素，对仔猪具有非常强的致死性，在C型产气荚膜梭菌感染治病的过程中，外毒素起着非常关键的作用［4］，研究表明，C型产气荚膜梭菌毒素引起初生仔猪100%死亡的剂量是75个小鼠MLD，80个小鼠MLD可引起家兔100%死亡。
参考文献：
［1］ 张红英，杨  霞，卢中华.魏氏梭菌肠毒素研究进展［J］.中国畜牧兽医,2004,31(9):35-37
［2］ 刘泽文，熊忠良，杨克礼，等．新生仔猪红黄痢二联灭活疫苗的研制与应用Ⅰ—C型魏氏梭菌生物学特性研究［J］．安徽农业科学，2008，36（21）：9063－9064．
［3］ 韩学波，曾  瑾，王玉炯，等. C 型产气荚膜梭菌保护性抗原的免疫原性［J］.中国生物制品学杂志，2008,21(3):201-203.
［4］ 斯特劳 B E. 猪病学［M］.赵德明，张中秋，沈建忠，译.北京：中国农业出版社，2000.

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本文编号：16203