鸭疫里默氏杆菌siderophore基因的克隆与表达

发布时间：2015-03-03 17:48

 

鸭疫里默氏杆菌siderophore基因的克隆与表达

赖丽萍1 ,黄藏宇2

（1.浙江大学动物科学学院,杭州  310058;2.浙江省嘉兴市畜牧兽医局,浙江嘉兴 314000）

基因序列，克隆至pGEM-T easy载体后进行序列测定及分析。结果表明，阅读框架全长为729 bp，编码243个氨基酸。将该基因克隆到原核表达载体pET-28a后，转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达，经SDS-PAGE分析结果显示，已成功表达28 ku的融合蛋白。

基因；克隆；表达

鸭疫里默氏杆菌病是由鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer，RA)引起的一种接触性传染性疾病，又称为鸭传染性浆膜炎[1]。多见于1~8周龄的雏鸭，呈急性或慢性败血症，临诊上主要表现为眼和鼻分泌物增多、喘气、咳嗽、下痢、共济失调和头颈震颤，少数慢性病例出现头颈歪斜等症状，在病变上以纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、脑膜炎及部分病例出现关节炎为特征，本病呈世界性流行，是危害养鸭业最为严重的传染病之一[2-4]。为了从根本上提高对鸭疫里默氏杆菌的预防控制水平，必须对鸭疫里默氏杆菌的分子致病机制进行全面深入的研究，对鸭疫里默氏杆菌铁siderophore基因进行了克隆与表达，为进一步研究载铁体的免疫与生物学功能奠定了基础。

1  材料与方法

1.1  试验材料

（公司；限制性内切酶及T4 DNA连接酶购自宝生物（大连）工程有限公司。

-TAGGATCCATGCCTAAGACACCGAAATG-3

siderophore基因序列。

）酶

琼脂糖凝胶电泳回收目的片段，连接后转化至卡那霉素的的

M    1    2

2000 bp

750 bp

1000 bp

750 bp

500 bp

250 bp

100 bp

图1 .siderophore基因的PCR扩增

2.2  目的基因的克隆与鉴定

15000 bp

M        1

5369 bp

750 bp

10000 bp

7500 bp

5000 bp

2500 bp

1000 bp

500 bp

结果

siderophore基因序列与之前已经报道的鸭疫里默氏杆菌的相应序列进行比较，发现同源性达到98%以上。

3  小结与讨论

在自然界中绝大部分铁却要么是以细菌不能利用的化学形态的形式存在，要么是深埋于矿物颗粒中，所以自然界中细菌能够利用的称为生物有效铁是很少的。在进化过程中，许多细菌进化获得了摄取铁的能力，大多通过细菌分泌一种叫铁载体的小分子化合物(结构不同，种类非常繁多)。铁载体就是大多数微生物合成并输出的一种螯合铁的用于摄取铁元素的低分子复合物[5,6]。它能够将铁离子紧紧束缚住，其他微生物就不能再将这些铁据为己

M       1      2     3      4

28 ku

170 ku

34 ku

26 ku

43 ku

55 ku

72 ku

95 ku

130 ku

有了。铁载体还可以帮助细菌将一些深埋于矿物或其他螯合物中的铁离子拽出来，使得某些病原细菌敢于侵袭宿主细胞，如人体细胞中的铁离子是与转移蛋白、血红蛋白这些组分紧密结合在一起的，但病原菌使用铁载体夺取这些铁离子很容易，铁载体就被称为这些病原侵犯人体的一把杀手锏。

等致病因子已有研究

参考文献：

[2] 卡尔尼克 B W .禽病学[M].第10版.北京：中国农业大学出版社,1999,195-202. 

rRNA homology group[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,1993,43(4):768-776.

[4] Miethke M, Marahiel M A. Siderophore-based iron acquisition and pathogen control[J].Microbiology and Molecular Biology Reviews,2007,71 (3): 413-451.

细菌营养竞争的有力武器

的筛选鉴定及其铁载体特性研究

[8] Hu Q,Han X,Zhou X,et al. OmpA is a virulence factorofRiemerellaanatipestifer[J].Vet Microbiol,2011,150(3): 278-288.

              

                                                                                                             

甘肃省高产优质苜蓿建设项目进展良好

作为全国面积最大的紫花苜蓿草基地，甘肃省以“振兴奶业苜蓿发展行动”为契机，实施国家奶牛优质苜蓿标准化高产创建6 000hm2，配套田间灌溉设施，推广苜蓿品种良种化开展标准化种植、机械化收割加工。目前项目建设稳步推进，进展良好。

苜蓿被称为“饲草之王”，是发挥奶牛遗传潜力和提高牛奶质量的优质牧草。2012年开始，国家启动实施“振兴奶业苜蓿发展行动”，中央财政每年安排5.25亿元，在奶牛主产省和苜蓿主产省开展奶牛优质苜蓿标准化高产创建。甘肃省制定了全省高产优质苜蓿示范建设项目实施方案，要求各地严格组织实施。对补助资金进行分账核算、专款专用。由科研教学、技术推广等方面专家实行包片挂钩技术指导，有效提高了建设质量水平。各地把发展苜蓿草产业作为优化农业结构和增加农民收入的关键措施，在征地、用水、税收、信贷等方面制定优惠政策。目前，全省紫花苜蓿种植面积已达63.4万hm2。（来源: 人民网甘肃频道）

                                                                                                             

我国首次获得成活iPS克隆猪

笔者从中科院广州生物医药与健康研究院获悉，来自该研究院、浙江大学、华大基因研究所等机构的科研人员，在世界上第一次获得成活的iPS克隆猪，从而标志着我国在大动物iPS研究方面取得了标志性进展。

据介绍，猪的生理特征、组织细胞结构和人类十分类似，因此，猪等大动物的诱导多能性干细胞（iPS细胞）研究受到世界各国的重视。但由于目前对iPS诱导机制还缺乏了解，全世界诱导获得的猪iPS细胞制作克隆猪此前一直未能成功。

此项最新研究由中国工程院院士李宁和我国十多个研究单位共同完成。研究人员发现，外源基因的表达和表观遗传学可能是影响iPS克隆胚胎发育的主要原因。广州生物医药健康研究院赖良学团队将浙江大学肖磊实验室获得的猪iPS细胞分化4 ~6d，一方面使iPS细胞退出快速的细胞周期，，另一方面使外源基因表达下降后再进行核移植，分化后的iPS细胞核移植后体外发育囊胚率由原来的5%提高到20%左右。通过将这些分化iPS细胞克隆胚胎移植代孕受体，赖良学团队在2011年率先获得健康活泼的克隆小猪一头。随后，华大基因研究所杜玉涛课题组将猪iPS用去乙酰化抑制剂后，采用手工克隆方法于2012年获得了4头iPS克隆猪。                             

（来源: 中国畜牧兽医报）

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