mTOR信号通路对山羊骨骼肌卫星细胞增殖及分化的影响

发布时间：2018-06-03 23:27

  本文选题：雷帕霉素靶蛋白 + 肌细胞增强因子2　； 参考：《内蒙古大学》2015年博士论文

【摘要】：骨骼肌分化过程是卫星细胞(Satellite cells, SCs)退出细胞周期融合成为多核肌管的过程,这个过程是肌细胞决定因子1(Myogenic differentiation 1, MyoD1)调控肌细胞生成素(Myogenin, MyoG)的表达而完成的。同时,肌细胞增强因子2 (Myocyte enhancer factor 2, MEF2)结合于肌肉组织特异性表达基因的调控区,增强肌肉组织蛋白的合成。肌细胞的增殖与分化受到营养、激素和自分泌因子的影响。亮氨酸引发产生的代谢合成信号,促使雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin, mTOR)转移到溶酶体表面进而Ras蛋白脑组织同源类似物(Ras homolog enriched in brain, Rheb)可以激活它；与此同时,胰岛素样生长因子1(Insulin like growth factor I, IGF-1)抑制结节性硬化症蛋白复合物2(Tuberous sclerosis complex 2, TSC2),导致mTOR释放。激活后的mTOR磷酸化其下游的底物,如真核生物翻译起始因子4E结合蛋白(Eukaryotic initiation factor 4E-binding protein-1,4E-BP1)和核糖体蛋白S6激酶(Ribosomal protein S6 kinase-1, S6K1),刺激肌肉蛋白的合成并促使肌肉肥大。同时,4E-BP1、S6K和蛋白磷酸酶2A(Protein phosphatases 2A, PP2A)等mTOR底物参与多条信号通路调控骨骼肌的发育。虽然,在骨骼肌发育过程中,目前对于mTOR激活的研究已经比较清楚。但是,其下游通过何种途径来调控MyoD1和MEF2,继而调控骨骼肌相关基因的表达等方面的研究尚未可知。在本研究中,首先用两步酶消化法和差速贴壁法分离并纯化山羊骨骼肌卫星细胞(goat Skeletal satellite cells, gSSCs),并对其进行鉴定和诱导分化。结果显示,采用0.1%I型胶原酶和0.25%胰蛋白酶两步消化法可以有效分离gSSCs,PO代gSSCs差速贴壁培养24h后,有少量细胞贴壁生长；72h后大量的细胞贴壁生长。用免疫组化法检测gSSCs中标记基因Desmin、alpha-Actin、MyoD1、生肌调节因子5 (Myogenic regulatory factor 5, Myf5)和配对盒基因7 (Paired box 7,PAX7)的表达情况,结果得到的细胞中这5个基因表达均呈阳性。成肌诱导后第1d细胞发生聚集生长,第3d时出现细胞融合现象而且融合的细胞折光度较强。第5-7d时形成粗大的肌管并有分支出现,且肌管中表达快肌肌球蛋白(Fast muscle myosin, FMM)。以分离纯化后的gSSCs为细胞模型探究mTOR信号通路对MEF2C的调控作用。不同浓度的PP242处理gSSCs 3h后,随着PP242(一种特异性mTOR小分子抑制剂)浓度的增加S6K和MEF2C (S59)磷酸化水平同步降低,而S6K和MEF2C在细胞中的蛋白总量并没有变化。当PP242浓度为100 nM时,S6K和MEF2C活性得到很好的抑制。在MEF2C免疫共沉淀产物中,大约50kD处,PP242处理前蛋白量较多,而处理后的蛋白量较少；且该处蛋白中8号蛋白整合素连接激酶(Integrin linkedkinase, ILK)属于mTOR信号通路中的蛋白。用100nM PP242处理gSSCs3h后,ILK的表达量没有明显变化(P0.05),但其磷酸化水平升高了近1.7倍(1.6816土0.061,P0.05,对照为1.0±0.054,P0.05)；同时,MEF2C与ILK共定位于gSSCs中。随着Cpd22(一种特异性ILK小分子抑制剂)浓度的增加ILK的磷酸化水平在降低,而不影响ILK的表达量。当1000nM Cpd22处理gSSCs 3h后,ILK活性得到很好的抑制,而且MEF2C (S59)活性提高了近1.6倍(1.5526土0.054,P0.05),蛋白表达量并没有变化(P0.05)。ILK活性的抑制在一定程度上阻断mTOR信号通路对MEF2C的作用。在体外ILK会促进MEF2C 59位丝氨酸残基的去磷酸化,且mTOR和ILK都调控肌酸激酶(MCK)的表达；与药物处理结果一致,shRNA干扰ILK的表达却增强了 MEF2C的活性和MCK的表达。在gSSCs诱导分化过程中,100 nM PP242极大地抑制了其分化过程,只有极少数的细胞发生融合,没有形成明显的肌管,且只有0.73%的细胞发生融合并表达肌球蛋白重链(Myosin heavy chain,MHC)。在gSSCs诱导时加入PP242 24h后,S6K的表达量没有明显变化(P0.05),但其活性受到抑制；MyoD1的表达量和活性都没有受到影响；MyoG的蛋白表达量(0.3892±0.037,P0.05,Control:1.0034±0.056,P0.05)和mRNA转录量(0.362±0.019,P0.05,Control: 1.0054±0.057,P0.05)均降低。MyoD1免疫共沉淀后,PP242处理24 h后约90KD位置处的蛋白含量明显高于对照组；其中6#蛋白信号转导和转录激活因子1(Signal transducer and activator of transcription 1,STAT1)和MyoD1共定位于核内和胞质且相互免疫共沉淀均呈阳性。PP242抑制mTOR活性24h后,STAT1的表达量和磷酸化水平都没有受到影响,但是其核内含量增加了大约2.3倍(2.3304±0.049,P0.05,对照组：1.0023±0.065,P0.05)；MyoD1核内含量没有明显变化。在诱导过程中干扰STAT1,STAT1的表达量急剧降低(0.3016±0.031,P0.05,对照组：1.0134±0.067,P0.05),但MyoD1的表达量和磷酸化水平均无明显变化,MyoG的mRNA转录水平显著升高(2.2901±0.081,P0.05)。当转染STAT1-shRNA后,PP242对MyoG的转录调控受阻(1.765±0.058,P0.05),但没有完全被抑制。基于以上实验结果,本研究成功建立了gSSCs体外分离、纯化、培养和鉴定的方法,并发现mTOR信号通路正调控MEF2C和负调控ILK; ILK负调控MEF2C, mTOR通过调节STAT1核内含量调控MyoD1的转录。研究结果表明mTOR信号通路调控MEF2C的活性及转录活性,同时调控MyoD1的转录活性,进一步调控gSSCs增殖和分化。
[Abstract]:楠ㄩ�艰倢鍒嗗寲杩囩▼鏄�鍗�鏄熺粏鑳�(Satellite cells, SCs)閫，

本文编号：1974713