奶牛产奶性状候选基因GPIHBP1功能验证及基于RNA-seq候选基因挖掘

发布时间：2023-11-24 23:18

　　产奶性状是奶牛最为重要的经济性状,筛选和挖掘影响奶牛产奶性状的功能基因或致因突变是奶牛分子育种研究中的研究热点。本课题组基于前期全基因组关联分析结果筛选出GPIHBP1基因作为产奶性状重要的候选功能基因。为了探究GPIHBP1基因在产奶性状上的生理功能以及作用机制,本研究在牛原代乳腺上皮细胞中进行了GPIHBP1基因功能验证研究。同时为进一步全面挖掘影响奶牛产奶性状的候选基因,本研究采取RNA-seq技术对奶牛不同泌乳时期的基因转录组水平进行研究,筛选调控奶牛泌乳过程的差异表达基因,为后续开展基因功能验证提供依据。 本研究通过在奶牛原代乳腺上皮细胞中进行GPIHBP1表达载体瞬时转染研究以及RNA干扰试验,并使用荧光定量PCR试验检测了乳脂乳蛋白合成代谢相关基因的表达变化,对其进行功能分析。研究发现在牛原代乳腺上皮细胞中瞬时转染GPIHBP1表达载体之后,4种酪蛋白基因(CSN1S1、CSN1S2、CSN2以及CSN3)以及乳铁蛋白基因(LTF)的表达水平均呈现下调趋势,而p乳球蛋白基因(LGB)的表达水平呈现上调趋势。脂蛋白脂肪酶基因(LPL)、CD36基因、极低密度脂蛋白受体基因(...

【文章页数】：173 页

【学位级别】：博士

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摘要
ABSTRACT
目录
第一章 文献综述
    1.1 QTL研究概述
    1.2 全基因组关联分析
        1.2.1 GWAS在畜禽中的应用
        1.2.2 GWAS中存在的问题
    1.3 GPIHBP1基因研究进展概述
        1.3.1 GPIHBP1基因的结构特点
        1.3.2 GPIHBP1基因敲除小鼠
        1.3.3 GPIHBP1基因突变与人的乳糜微粒血症
        1.3.4 GPIHBP1基因的表达和调控
        1.3.5 GPIHBP1参与LPL的转运
        1.3.6 牛GPIHBP1基因研究现状
    1.4 RNA测序
        1.4.1 RNA-seq平台
        1.4.2 RNA-seq原理
        1.4.3 RNA-Seq技术优势
        1.4.4 RNA-seq技术的应用
        1.4.5 RNA-Seq的发展前景以及面临的挑战
    1.5 研究目的和意义
第二章 GPIHBP1基因细胞功能验证
    2.1 试验材料
        2.1.1 试验样品
        2.1.2 主要试剂和溶液配置
        2.1.3 主要试验仪器
    2.2 试验方法
        2.2.1 组织以及细胞RNA提取
        2.2.2 反转录
        2.2.3 PCR反应体系及反应条件
        2.2.4 荧光实时定量PCR反应体系及反应条件
        2.2.5 Taq-man探针法定量PCR反应体系及反应条件
        2.2.6 GPIHBP1表达载体构建
        2.2.7 细胞培养
        2.2.8 瞬时转染原代牛乳腺上皮细胞
        2.2.9 siRNA设计及转染
        2.2.10 统计分析
    2.3 结果与分析
        2.3.1 组织RNA提取以及反转录结果
        2.3.2 组织特异性表达分析
        2.3.3 牛GPIHBP1基因序列分析
        2.3.4 牛GPIHBP1可变剪切体分析
        2.3.5 GPIHBP1可变剪切体定量分析
        2.3.6 GPIHBP1基因表达载体的构建
        2.3.7 GPIHBP1基因表达载体的牛乳腺上皮转染
        2.3.8 GPIHBP1基因过表达细胞定量PCR检测
        2.3.9 GPIHBP1基因siRNA预实验
        2.3.10 GPIHBP1基因siRNA细胞定量PCR检测
    2.4 讨论与小结
        2.4.1 牛GPIHBP1基因可变剪切体
        2.4.2 牛GPIHBP1基因组织特异性表达分析
        2.4.3 牛GPIHBP1基因对乳蛋白乳脂相关基因的调控作用
第三章 牛GPIHIBP1启动子活性分析
    3.1 试验材料
        3.1.1 试验样品
        3.1.2 主要试剂和溶液配置
        3.1.3 主要试验仪器
    3.2 试验方法
        3.2.1 基因组DNA的提取
        3.2.2 GPIHBP1基因启动子区序列分析
        3.2.3 RNA提取及反转录
        3.2.4 实时荧光定量PCR反应体系及反应条件
        3.2.5 启动子重组质粒构建
        3.2.6 质粒提取
        3.2.7 293T细胞培养
        3.2.8 293T细胞转染
        3.2.9 双荧光素酶检测试验
        3.2.10 转录因子结合位点预测
        3.2.11 凝胶阻滞试验(EMSA)
        3.2.12 统计分析
    3.3 结果与分析
        3.3.1 基因组DNA的提取结果
        3.3.2 GPIHBP1启动子区序列分析
        3.3.3 启动子重组载体构建
        3.3.4 GPIHBP1启动子活性测定
        3.3.5 GPIHBP1启动子区转录因子结合位点预测
        3.3.6 凝胶阻滞结果
        3.3.7 GPIHBP1启动子区单倍型关联分析
        3.3.8 GPIHBP1分型表达结果
    3.4 讨论
        3.4.1 GPIHBP1启动子活性分析与分型定量表达分析
        3.4.2 启动子活性分析及凝胶阻滞试验
        3.4.3 育种值关联分析
第四章 中国荷斯坦奶牛产奶性状转录组分析
    4.1 试验材料
        4.1.1 资源群体的构建
        4.1.2 主要试剂和溶液配置
        4.1.3 主要试验仪器
    4.2 试验方法
        4.2.1 血样采集
        4.2.2 奶样采集
        4.2.3 RNA提取与质量控制
        4.2.4 cDNA文库制备与测序
        4.2.5 cDNA文库转录组测序
        4.2.6 转录组测序原始数据质控
        4.2.7 测序reads比对
        4.2.8 未注释基因和转录本的检测
        4.2.9 差异表达基因、差异性剪切和差异性启动子使用的检测
        4.2.10 差异表达基因与Animal QTL数据库比对分析
    4.3 结果与分析
        4.3.1 RNA提取结果
        4.3.2 RNA测序质量
        4.3.3 Reads比对结果
        4.3.4 差异表达基因筛选
        4.3.5 时期特异性差异表达基因
        4.3.6 差异表达基因与QTL信息比对
        4.3.7 Pathway分析和GO分析
        4.3.8 差异剪切分析
        4.3.9 Promoters差异分析
    4.4 讨论
        4.4.1 牛奶RNA来源
        4.4.2 牛血差异基因分析
        4.4.3 牛奶差异基因分析
        4.4.4 较少差异表达基因位于QTL数据库内的原因
        4.4.5 GO分析和pathway分析
        4.4.6 可变剪切体分析
第五章 结论
参考文献
致谢
个人简历
附录



本文编号：3866796