RNF4互作蛋白AR调控未成熟猪睾丸支持细胞增殖的分子机制研究

发布时间：2024-01-14 12:54

　　精子发生是一个需要多种细胞共同参与的过程,其中支持细胞由于其特异的生理功能,对精子发生发挥着重要的作用。大量研究表明,支持细胞的增殖受到miRNA以及其它因子的调节。课题组前期研究发现环指蛋白4(ring finger protein4,RNF4)与雄激素受体(androgen receptor,AR)在猪睾丸细胞(swine testicular cell,ST)内共定位,并可能通过AR影响ST细胞生长。本课题在这个实验结果的基础上,以AR基因为主要研究对象,探究AR是否和RNF4存在互作以及AR在ST细胞增殖中的功能,并探究调控AR表达的分子机制。本课题主要研究结果如下:1、RNF4与AR互作的研究通过Co-IP证明AR和RNF4在ST细胞内结合,缺失AR基因DBD(DNA binding domain)结构域后,AR与RNF4的结合消失。2、AR在睾丸组织中的表达以及对ST细胞的影响通过组织切片免疫荧光技术检测AR在性成熟前后大白猪睾丸中的表达。实验结果表明在60日龄和180日龄的大白猪睾丸中,AR均有表达。构建AR的超表达载体以及合成AR的干扰片段,通过qRT-PCR和West...

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【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
缩略词表
第一章 文章综述
    1 研究问题的由来
    2 精子发生
        2.1 精子发生过程
        2.2 睾丸支持细胞在精子发生中的功能
    3 雄激素受体基因研究进展
    4 RNF4基因研究进展
    5 miRNA在精子发生过程中的研究
        5.1 miRNA在精子发生过程中的功能研究
        5.2 miR-124a的研究进展
    6 研究目的与意义
第二章 AR调控未成熟猪睾丸支持细胞增殖的分子机制研究
    1 试验材料
        1.1 细胞系
        1.2 组织
        1.3 菌株、载体和抗体
        1.4 主要仪器和设备
        1.5 主要试剂与试剂盒
        1.6 常用试剂及配制
        1.7 生物信息学网站及分析软件
        1.8 统计学方法
    2 试验方法
        2.1 RNF4与AR的互作
            2.1.1 AR含HA标签载体构建
            2.1.2 细胞的复苏
            2.1.3 细胞的培养
            2.1.4 细胞的冻存
            2.1.5 细胞的转染
            2.1.6 免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)
            2.1.7 Westernblot
        2.2 AR的功能研究
            2.2.0 猪睾丸组织切片免疫荧光
            2.2.1 AR真核表达载体构建及干扰片段合成
            2.2.2 细胞转染
            2.2.3 细胞总RNA提取
            2.2.4 cDNA的制备
            2.2.5 实时荧光定量PCR检测AR及相关基因mRNA表达水平
            2.2.6 总蛋白提取
            2.2.7 蛋白浓度的测定
            2.2.8 Westernblot
            2.2.9 流式细胞术分析细胞周期
            2.2.10 Cellcountingkit-8(CCK-8)检测细胞增殖
        2.3 miR-124a功能研究
            2.3.1 AR的靶miRNA预测
            2.3.2 双荧光素酶报告载体的构建
            2.3.3 miR-124a模拟物和抑制物的合成
            2.3.4 细胞转染
            2.3.5 双荧光素酶活性检测
            2.3.6 突变型双荧光素酶报告载体的构建
            2.3.7 细胞总RNA提取
            2.3.8 cDNA制备
            2.3.9 实时荧光定量PCR检测miR-124a和基因mRNA的表达水平
            2.3.10 细胞总蛋白提取
            2.3.11 蛋白浓度测定
            2.3.12 Westernblot
            2.3.13 流式细胞术分析细胞周期
            2.3.14 CCK8分析细胞增殖
    3 结果
        3.1 RNF4与AR互作关系的鉴定
        3.2 AR对细胞的影响
            3.2.1 AR在猪睾丸组织中的表达
            3.2.2 AR超表达与抑制表达验证
            3.2.3 AR对细胞周期的影响
            3.2.4 AR对细胞增殖的影响
            3.2.5 缺失AR基因DBD对细胞周期和增殖的影响
        3.3 miR-124a与AR基因3’UTR的验证
            3.3.1 AR靶miRNA预测
            3.3.2 靶位点验证
            3.3.3 miR-124a对AR基因表达调控的验证
        3.4 miR-124a对细胞的影响
            3.4.1 miR-124a对细胞周期的影响
            3.4.2 miR-124a对细胞增殖的影响
    4 讨论
        4.1 睾丸支持细胞增殖的研究
        4.2 RNF4与AR的互作
        4.3 miR-124a、AR与未成熟猪睾丸支持细胞增殖
第三章 结语
    1 主要结论
    2 下一步工作
参考文献
致谢



本文编号：3878268