非洲猪瘟病毒蛋白p54原核真核表达、间接ELISA检测方法建立及单克隆抗体制备

发布时间：2024-01-17 15:11

　　目的：利用PET原核表达系统和pFastBac/NT-TOPO真核表达系统分别表达出非洲猪瘟病毒蛋白p54，建立检测非洲猪瘟血清抗体的间接ELISA方法。同时制备p54的单克隆抗体。 方法：将非洲猪瘟病毒蛋白p54的基因克隆到原核表达载体pET-52b(+)3C/LIC上，再转入大肠杆菌BL21(ED3)中，获得重组表达蛋白p54。超声破碎菌体，取离心后上清进行SDS PAGE和Western blot分析。优化诱导表达条件，利用表达蛋白上的六组氨酸标签进行蛋白纯化，获得高纯度的p54。将纯化后的p54包被酶标板，建立检测非洲猪瘟血清抗体的间接ELISA方法。 将非洲猪瘟病毒蛋白p54基因克隆到真核载体pFast/NT-TOPO上，转入大肠杆菌DH5α中，扩大培养后涂布抗生素筛选平板，挑取生长的单克隆菌落获得重组质粒，经PCR鉴定正确后，转入大肠杆菌DH10Bac中，获得重组杆状病毒质粒。利用脂质体介导，获得重组杆状病毒。用重组杆状病毒感染sf9细胞，72h后收集细胞，超声破碎，取离心后上清进行SDS-PAGE和Western-blot分析。用上清包被酶标板，建立检测非洲猪瘟血清抗体的...

【文章页数】：92 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
英文缩写表
目录
第一章 前言
    1.非洲猪瘟的流行趋势
    2.非洲猪瘟的病理学特征
        2.1 非洲猪瘟的临床特征
        2.2 非洲猪瘟常见宿主
        2.3 非洲猪瘟病的传播途径
    3. 非洲猪瘟病毒形态学特征和主要组成蛋白
    4.非洲猪瘟检测方法
        4.1 病毒分离
        4.2 分子生物学检测方法
            4.2.1 常规 PCR
            4.2.2 实时定量荧光 PCR
            4.2.3 圆环介导的等温扩增
        4.3 免疫学检测方法
            4.3.1 抗原检测
            4.3.2 抗体检测
    5. 本研究的目的及意义
    6. 技术路线
第二章 非洲猪瘟病毒蛋白 p54 的原核表达及间接 ELISA 方法的建立
    1.实验材料
        1.1 主要实验试剂和仪器
        1.2 主要溶液配方
    2. 实验方法
        2.1 p54 原核表达载体构建
            2.1.1 目的基因扩增
            2.1.2 目的基因片段回收
            2.1.3 目的基因与表达载体连接
            2.1.4 原核表达载体的转化和鉴定
                2.1.4.1 大肠杆菌感受态细胞的制备
                2.1.4.2 阳性克隆的筛选及鉴定
        2.2 大肠杆菌的诱导表达及条件优化
        2.3 重组表达蛋白的纯化及 Western-blot 分析
            2.3.1 重组表达蛋白的纯化
            2.3.2 重组表达蛋白的 Western-blot 分析
        2.4 间接 ELISA 方法的建立
            2.4.1 包被浓度和血清稀释度的确定
            2.4.2 ELISA 最佳反应条件的确定
            2.4.3 重复性评价
            2.4.4 阴阳性判定阈值与检测限的判定
            2.4.5 符合率、特异性和灵敏性的评价
    3 实验结果
        3.1 原核表达载体的构建
            3.1.1 目的基因的扩增
            3.1.2 原核表达载体的鉴定
            3.1.3 蛋白表达条件的优化
            3.1.4 表达蛋白纯化的 SDS PAGE 和 Western blot 分析
        3.2 间接 ELISA 方法的建立
            3.2.1 最佳包被浓度和血清稀释倍数的确定
            3.2.3 最佳反应条件的确定
            3.2.4 重复性评价
            3.2.5 阴阳性判定阈值与检测限的确定
            3.2.6 符合率、灵敏性和特异性的评价
第三章 非洲猪瘟病毒蛋白 p54 的真核表达及间接 ELISA 方法的建立
    1.实验材料
        1.1 主要实验试剂和仪器
        1.2 主要溶液配方
    2. 实验方法
        2.1 真核表达载体的构建
            2.1.1 目的基因的扩增
            2.1.2 目的基因与载体连接
            2.1.3 重组质粒的转座和鉴定
            2.1.4 bacmid 的脂质化
            2.1.5 重组杆状病毒的获得
        2.2 重组蛋白的 SDS-PAGE 和 Western-blot 分析
        2.3 间接 ELISA 检测方法的建立
            2.3.1 最佳包被浓度和血清稀释倍数的确定
            2.3.2 ELISA 最佳反应条件的确定
            2.3.3 重复性评价
            2.3.4 阴阳性判定阈值与检测限的判定
            2.3.5 符合率、特异性和灵敏性的评价
    3. 实验结果
        3.1 真核表达载体的构建
            3.1.1 目的基因的扩增
            3.1.2 真核重组载体的鉴定
            3.1.3 重组杆状病毒鉴定
            3.1.4 重组杆状病毒的获得
        3.2 重组蛋白的 SDS-PAGE 和 Western-blot 检测
        3.3 间接 ELISA 检测方法的建立
            3.3.1 最佳包被浓度和血清稀释倍数的确定
            3.3.2 最佳反应条件的确定
            3.3.3 重复性评价
            3.3.4 阴阳性判定阈值与检测限的判定
            3.3.5 符合率、灵敏性和特异性的评价
第四章 非洲猪瘟病毒蛋白 p54 单克隆抗体制备
    1.实验材料
        1.1 主要实验试剂和仪器
        1.2 主要溶液配方
    2 实验方法
        2.1 抗原免疫
        2.2 免疫小鼠的选择及免疫血清效价的测定
        2.3 骨髓瘤细胞 SP2/0 的培养和饲养细胞的制备
            2.3.1 骨髓瘤细胞 SP2/0 的培养
            2.3.2 饲养细胞制备
        2.4 小鼠脾细胞与 SP2/0 细胞融合
            2.4.1 小鼠脾细胞的获取
            2.4.2 细胞融合
        2.5 杂交瘤细胞的筛选及克隆
        2.6 细胞建株
        2.7 腹水型单抗制备
    3 实验结果
        3.1 免疫小鼠的选择及免疫血清效价的测定
            3.1.1 免疫小鼠的选择
            3.1.2 免疫血清效价测定
        3.2 杂交瘤细胞的筛选
        3.3 腹水型单抗的制备及纯化
第五章 小结与讨论
    1. 小结
    2. 讨论
参考文献
在读期间发表论文和学术交流情况
致谢



本文编号：3879309