猪链球菌2型(p)ppGpp合成酶与核糖体相互作用的研究

发布时间：2024-02-03 07:49

　　严谨反应是细菌在遭受环境压力和营养不足时,为了生存必须快速感知和适应不断变化的环境而发生的调控反应。研究严谨反应对于掌握细菌的生存机制以及掌握感染动物的发病机制有着重要的研究意义。细菌的严谨反应是由(p)ppGpp信号分子介导的,该信号分子是由细菌的RSH (RelA/SpoT Homologue)蛋白质催化合成。猪链球菌2型(SS2)基因组编码2个(p)ppGpp合成酶RelA和RelQ, RelA含有1个(p)ppGpp合成结构域(RSD)、1个(p)ppGpp水解结构域(HD)及2个与调控相关的结构域(TGS和ACT),而RelQ只含有1个(p)ppGpp合成结构域(RSD)。本实验室的前期研究发现,RelA单独负责葡萄糖饥饿时SS2的(p)ppGpp合成,而RelA和RelQ共同参与氨基酸饥饿和铁饥饿时SS2的(p)ppGpp合成。一般认为,RelA/RelQ是通过与核糖体相互作用来调控其(p)ppGpp合成或水解活性的。鉴于RelA和RelQ的结构和功能的差异,我们推测它们可能与核糖体亚基存在不同的相互作用。为此,开展了猪链球菌2型RelA和RelQ与核糖体亚基相互作用的研究...

【文章页数】：71 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
缩略语表
1 文献综述
    1.1 猪链球菌概述
    1.2 严谨反应
        1.2.1 概述
        1.2.2 (p)ppGpp的代谢及调控
        1.2.3 (p)ppGpp与转录调控
        1.2.4 (p)ppGpp与翻译调控
        1.2.5 (p)ppGpp对细菌生理机能的影响
    1.3 RelA与RelQ的关系研究
2 研究目的与意义
3 材料与方法
    3.1 菌株和质粒
    3.2 实验相关试剂
        3.2.1 主要试剂
        3.2.2 常用培养基和抗生素
        3.2.3 细菌双杂交试剂
        3.2.4 常用缓冲液
    3.3 猪链球菌2型双杂交文库的构建
        3.3.1 猪链球菌2型基因组的提取
        3.3.2 引物的设计与合成
        3.3.3 PCR产物的回收
        3.3.4 酶切与连接
        3.3.5 感受态细胞的制备
        3.3.6 连接产物的转化
        3.3.7 菌落PCR初步筛选和测序鉴定
        3.3.8 质粒的小量制备
    3.4 猪链球菌2型(p)ppGpp合成酶与核糖体的相互作用
        3.4.1 细菌双杂交自激活实验的验证
        3.4.2 RelA、RelQ分别与核糖体亚基双杂交
        3.4.3 RelA中RSD结构域与核糖体亚基双杂交
    3.5 猪链球菌2型(p)ppGpp合成酶缺失突变体的构建及表型研究
        3.5.1 引物的设计与合成
        3.5.2 relQ上下游同源臂和氯霉素抗性基因的扩增与纯化
        3.5.3 PCR产物的酶切、连接与转化
        3.5.4 质粒的小量制备
        3.5.5 缺失突变体重组质粒的酶切鉴定
        3.5.6 猪链球菌2型SC-19和△relA缺失突变株的电转化
        3.5.7 缺失突变菌株的抗性筛选
        3.5.8 缺失突变菌株的PCR鉴定
4 结果与分析
    4.1 猪链球菌2型双杂交文库的构建
    4.2 RelA、RelQ与核糖体亚基的相互作用
        4.2.1 RelA、RelQ蛋白结构分析
        4.2.2 细菌双杂交自激活实验的验证结果
        4.2.3 RelA、RelQ与核糖体的互作结果
        4.2.4 RelA中RSD结构域与核糖体互作结果
    4.3 猪链球菌2型(p)ppGpp合成酶缺失突变体的构建及表型
        4.3.1 自杀性重组质粒pSET4s-△relQ的构建及酶切鉴定
        4.3.2 猪链球菌2型△relQ和△relQ△relA缺失突变株单交换的筛选及PCR鉴定
5 讨论
    5.1 细菌双杂交方法的优势与缺点
    5.2 RelA/RelQ与核糖体亚基互作的蛋白
    5.3 RelA、RelQ以及RSD与核糖体互作蛋白的之间关系
    5.4 突变筛选中存在的问题
结论与展望
参考文献
附表
致谢



本文编号：3893986