利用CRISPR/Cas 9技术构建大肠杆菌aroA基因的敲除系统及其初步应用

发布时间：2024-02-13 17:02

　　旨在利用CRISPR/Cas 9新型基因编辑技术构建大肠杆菌aroA基因的敲除系统,并分析其对不同大肠杆菌aroA基因敲除、修复的差异。首先构建靶向aroA基因的CRISPR/Cas 9载体;随后人工设计同源修复供体基因序列,并亚克隆到CRISPR/Cas 9载体中,构建成完整的CRISPR/Cas 9基因敲除体系;将该系统分别应用到大肠杆菌DH10B、DH5α和JM109细胞中,PCR鉴定筛选到的阳性菌株,并回收其扩增条带进行克隆、测序。CRISPR/Cas 9载体的酶切与测序结果均正确,表明载体构建成功;PCR鉴定结果显示,该系统对三种大肠杆菌均能进行aroA基因的有效敲除,敲除效率为46%⁵8%;测序结果进一步证实目的基因敲除成功。本试验成功构建大肠杆菌aroA基因CRISPR/Cas 9敲除系统,为进一步研究致病菌aroA基因功能及开发减毒大肠杆菌疫苗提供新型、有效的基因敲除工具。

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【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 菌株和质粒
    1.2 主要试剂
    1.3 sgRNA的设计和相关引物的合成
    1.4 sgRNA载体的构建
    1.5 aroA基因同源臂(Donor)载体的构建
    1.6 含sgRNA及aroA基因同源臂载体的构建
    1.7 感受态细胞制备及细菌的转化
    1.8 稳定敲除aroA基因的DH5α、DH10B、JM109菌株的筛选
2 结果
    2.1 sgRNA载体的构建
    2.2 aroA基因同源臂载体的构建
    2.3 psgRNA-GFP-aroAsgRNA-Donor载体的构建
    2.4 对不同大肠杆菌aroA基因敲除效率的检测
3 讨论
4 结论



本文编号：3896955