猪传染性胸膜肺炎放线杆菌多重PCR检测方法的建立及OmpD15蛋白的抗原性分析

发布时间：2024-02-22 15:53

　　猪传染性胸膜肺炎(Porcine infectious pleuropneumonia)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，App)引起猪的一种高度传染性呼吸道疾病，又称为猪接触性传染性胸膜肺炎。该致病菌引起的主要病症为肺出血、坏死和纤维素性渗出等。该病于1957年首次报道，自报道以来该病已在世界范围内广泛流行，并给许多国家的养猪产业造成了严重的经济损失。针对该病治疗的越早，经济损失也越少的特点，建立一种快速、灵敏、高效的诊断方法已成为新的研究热点。 本研究根据胸膜肺炎放线杆菌表面抗原蛋白D15基因和16S rRNA分别设计一对引物，可以特异性扩增出637bp和431bp的目的片段。运用多重PCR技术，建立一种检测猪胸膜肺炎放线杆菌的方法。结果显示，已知的胸膜肺炎放线杆菌血清1型、3型、5a型、8型、10型均能扩增出特异性的目的片段。特异性检验时，血清型5a能扩增出目的片段，而其他对照细菌均未扩增出相应的目的片段；根据该多重PCR方法对临床分离的通过生理生化分析鉴定的5株疑似猪胸膜肺炎放线杆菌进行了分子鉴定，其中有4株鉴定为猪胸膜肺炎放...

【文章页数】：80 页

【学位级别】：硕士

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摘要
ABSTRACT
缩略词表
第一章 引言
    1.1 猪传染性胸膜肺炎
    1.2 病原学
    1.3 流行病学
    1.4 致病机理及其危害
        1.4.1 致病机理
        1.4.2 猪传染性胸膜肺炎的危害
    1.5 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌主要毒力因子
        1.5.1 溶血毒素（Apx）
        1.5.2 外膜蛋白（Omp）
        1.5.3 荚膜多糖（CPS）
        1.5.4 脂多糖（LPS）
        1.5.5 其他毒力因子
    1.6 诊断方法
        1.6.1 病原学方法
        1.6.2 血清型方法
        1.6.3 分子学诊断方法
    1.7 猪传染性胸膜肺炎的防制
    1.8 研究目的及意义
第二章 猪胸膜肺炎放线杆菌 PCR 检测方法的建立、药敏试验及 MIC 值的测定
    2.1 PCR 诊断方法的建立
        2.1.1 培养基及菌株
        2.1.2 酶类及主要试剂
        2.1.3 引物设计
        2.1.4 App 基因组提取
        2.1.5 PCR 扩增
        2.1.6 App PCR 特异性检测
        2.1.7 App PCR 敏感性检测
        2.1.8 重复性试验
    2.2 药敏试验及 MIC 值的测定
        2.2.1 培养基及实验菌株
        2.2.2 主要器材
        2.2.3 试验用药及药敏片制备
        2.2.4 药品原液制备及保存
        2.2.5 菌株的活化及菌液制备
        2.2.6 药敏试验
        2.2.7 MIC 的测定
        2.2.8 结果判定
    2.3 结果
        2.3.1 App 标准菌株 PCR 扩增
        2.3.2 App PCR 扩增特异性试验
        2.3.3 App 的敏感性试验
        2.3.4 重复性试验
        2.3.5 建立的 PCR 方法对临床分离菌株的鉴定
        2.3.6 药敏试验
        2.3.7 MIC 的测定结果
    2.4 讨论
        2.4.1 PCR 诊断方法的建立
        2.4.2 药敏试验及 MIC 值的测定
第三章 毒力因子 ApxⅠA、ApxⅡA、OmpD15 基因片段的克隆
    3.1 试验材料
        3.1.1 菌株和载体
        3.1.2 仪器及试剂
        3.1.3 工具酶及主要试剂配制
    3.2 ApxⅠA、ApxⅡA、OmpD15 片段的扩增与克隆
        3.2.1 基因组 DNA 的提取
        3.2.2 基因的扩增
        3.2.3 PCR 产物电泳及纯化
        3.2.4 PCR 产物与 pMD18-T 载体的连接
        3.2.5 感受态细胞制备
        3.2.6 连接产物的转化和阳性菌落的鉴定
        3.2.7 阳性克隆质粒的提取
        3.2.8 阳性克隆质粒序列测定
    3.4 结果
        3.4.1 ApxⅠC、ApxⅡA、 OmpD15 基因片段的克隆结果
        3.4.2 测序结果
    3.5 讨论
第四章 OmpD15 的原核表达及其抗原性分析
    4.1 OmpD15 基因的原核表达
        4.1.1 工具酶及主要试剂配制
        4.1.2 OmpD15 的基因扩增
        4.1.3 目的片段和载体的酶切、电泳及回收
        4.1.4 基因 OmpD15 的连接与转化
        4.1.5 重组表达质粒的提取与酶切鉴定
        4.1.6 pET32a-OmpD15 重组表达质粒的诱导表达
        4.1.7 pET32a-OmpD15 重组表达质粒表达产物的 SDS-PAGE 分析
        4.1.8 pET32a-OmpD15 重组表达质粒表达产物初步纯化
        4.1.9 pET32a-OmpD15 重组表达质粒表达产物的抗原性分析
    4.2 动物实验
        4.2.1 实验材料及实验动物
        4.2.2 主要试剂
        4.2.3 最小致死量（MLD）的测定
        4.2.4 抗体的监测
    4.3 结果
        4.3.1 OmpD15 基因的扩增
        4.3.2 重组表达质粒的提取与酶切鉴定
        4.3.3 pET32a-OmpD15 重组表达质粒表达产物的 SDS-PAGE 分析
        4.3.4 pET32a-OmpD15 重组表达质粒表达产物初步纯化
        4.3.5 pET32a-OmpD15 重组表达质粒表达产物的抗原性分析
        4.3.6 最小致死量（MLD）的测定
        4.3.7 抗体的监测
    4.4 讨论
第五章 结论
参考文献
附录
致谢
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本文编号：3906905