ISG15蛋白泛素结合酶UBCH6的原核表达及多克隆抗体制备

发布时间：2024-02-24 09:18

　　通过抽提接毒猪瘟病毒(CSFV)的PK-15细胞RNA,以RT-PCR方法克隆UBCH6基因,并与pMD18-T载体连接,再通过双酶切法将UBCH6基因与原核表达载体pGEX-4T-1、真核表达载体pcDNA3.0连接。重组原核表达载体pGEX-UBCH6用感受态细胞BL21转化,并在低温条件下,用低浓度的IPTG诱导表达UBCH6重组蛋白,经SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色结果显示,在30℃、用0.05 mmol/L IPTG诱导时UBCH6表达效果最好,而且UBCH6重组蛋白主要以可溶性的形式在菌液中表达。UBCH6重组蛋白经过Ni-NTA纯化后与弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂等体积混合乳化并免疫4周龄昆明小鼠,从而制备出UBCH6多克隆抗体,重组真核表达载体pcDNA3.0-UBCH6以化学转染人工脂质体法导入293T细胞中,Western blot检测制备的UBCH6多克隆抗体能与真核表达细胞蛋白发生反应,反应效价可达1∶10 000,反应性良好。Western blot检测UBCH6多克隆抗体的特异性,ISG15多克隆抗体、UBCH6多克隆抗体都能与接毒CSFV、转染Pol...

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【部分图文】：

图1猪UBCH6基因编码的氨基酸亲水性和抗原指数分析

对GenBank上收录的猪UBCH6基因序列(登录号:XM-021071421.1)全长1500bp,编码多肽的亲疏水性进行分析,选取编码亲水性良好且有线性表位的194个氨基酸的基因片段(图1)作为目的蛋白制备多克隆抗体。2.2猪UBCH6基因的扩增

图2PCR扩增UBCH6基因电泳图

原核重组质粒pGEX-UBCH6用感受态细胞BL21转化,分别用含0.05mmol/L、0.5mmol/LIPTG和不加IPTG的LB培养液,诱导表达重组蛋白。取未诱导重组菌菌液及诱导的菌液各1mL离心,菌体处理后用于SDS-PAGE电泳。诱导的重组菌超声波破碎裂解,分别....

图3重组原核、真核表达载体双酶切鉴定

图2PCR扩增UBCH6基因电泳图2.5原核重组蛋白的纯化与鉴定

图4SDS-PAGE和Westernblot分析重组菌原核表达的UBCH6蛋白

用稀释比例为1∶500的抗His标签鼠单克隆抗体通过Westernblot方法检测UBCH6的真核表达,结果如图6所示,重组真核表达质粒pcDNA-UBCH6在293T细胞中成功表达UBCH6蛋白。图5纯化UBCH6重组蛋白分析

本文编号：3908770