鉴别牛羊布鲁菌实时荧光定量PCR方法的建立

发布时间：2024-02-26 15:39

　　本试验旨在建立准确、快速的检测布鲁菌、羊种布鲁菌、牛种布鲁菌的方法。以BCSP31作为布鲁菌菌属特异性基因,以IS711插入元件作为布鲁菌菌种特异性标志,设计布鲁菌、羊种布鲁菌、牛种布鲁菌的特异性引物和Taqman探针,构建标准阳性质粒模板,优化了多重实时荧光定量PCR反应体系和条件,并将标准阳性质粒10倍倍比稀释作多重实时荧光定量PCR标准曲线,评价多重实时荧光定量PCR反应体系的敏感性、特异性、重复性,建立了鉴别牛羊种布鲁菌的实时荧光定量PCR方法,并用此方法对临床样品进行检测。结果显示：引物浓度400nM,探针浓度200nM,退火温度60℃为所建立多重实时荧光定量PCR的最佳反应体系和条件。此诊断方法可以特异地检测布鲁菌、牛布鲁菌、羊布鲁菌,不与其它革兰氏阴性细菌发生交叉反应,特别是与布鲁菌有强烈交叉反应的小肠结肠炎耶尔森菌O：9,表明其具有良好的特异性。另外,此诊断方法Cq值的变异系数均小于0.05,检测限为2.8fg～3.2fg,表明其具有良好的可靠性、稳定性及较高的敏感性。运用已建立的诊断方法对临床样品进行检测,其可以准确、快速的检测布鲁菌、羊种布鲁菌、牛种布鲁菌。

【文章页数】：55 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图3多重实时荧光PCR敏感性分析

图13种菌的目的片段的PCR扩增结果

菌的引物和探针的检测限分别为3.0、2.8、3.2fg，其相应的标准曲线斜率分别为-3.259、-3.258、-3.258，相关系数均为1，并有良好的线性关系。因此，可以根据所检测临床样品的Cq值，并参照标准曲线可对临床样品进行检测。2.3特异性试验结果将猪种、羊种、牛种布鲁菌菌....

图23种菌的重组质粒PCR扩增结果

系。因此，可以根据所检测临床样品的Cq值，并参照标准曲线可对临床样品进行检测。2.3特异性试验结果将猪种、羊种、牛种布鲁菌菌30002500200015001000500010203040图3多重实时荧光PCR敏感性分析相对荧光单位布鲁菌羊种布鲁菌牛种布鲁菌循环数1：M.DNA标....

图6。2.4重复性试验结果使用已建立的多重实时荧光010203040图6多重实时荧光定量PCR特异性检测结果

株的标准阳性质粒模板DNA各2μL同时加入多重实时荧光定量PCR体系。另外，将7株非布鲁菌菌株（小肠结肠耶尔森菌O：9、禽巴氏杆菌、乳酸菌、大肠杆菌O8、大肠杆菌O78、大肠杆菌O86、马流产沙门氏菌）的模板DNA、阴性对照（无菌水代替模板）各2μL分别加入多重实时荧光定量PCR....

本文编号：3911589