牦牛lncFAM200B的克隆鉴定、表达及生物信息学分析

发布时间：2024-03-02 08:22

　　旨在克隆鉴定牦牛lncFAM200B,为探索其在牦牛肌肉和脂肪发育过程中的调控作用奠定基础。以臀肌cDNA为模板,设计特异性引物扩增lncFAM200B全长序列,用在线软件CPC、CPAT对该lncRNA的编码能力进行预测,进一步通过原核表达试验鉴定其编码能力;采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)对lncFAM200B进行组织表达分析,通过TargetScan 7.1和miRanda预测与lncFAM200B具有潜在相互作用miRNA的靶基因,利用DAVID在线软件对靶基因进行GO和KEGG分析。结果显示,牦牛lncFAM200B长度为531 bp;相较于普通牛多59 bp,编码潜能为-1.287 4,且原核表达试验验证该lncRNA不具备蛋白编码能力,表明牦牛lncFAM200B确为lncRNA;组织表达谱研究表明,lncFAM200B在牦牛肺脏组织中表达量较高。与lncFAM200B具有潜在相互作用miRNA的靶基因,如Sirt1、SCD5、KLF9、PTEN和MYPN等,与肌肉和脂肪发育相关。为进一步探讨牦牛lncFAM200B在肌肉和脂肪发育中的生物学功能提供参考依据。

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【部分图文】：

图1克隆引物位置示意图

采用PrimerPremier5.0软件,根据张思欢[18]研究所得lncFAM200B序列设计克隆引物,克隆引物在牦牛基因组中的位置如图1所示。以克隆所得全长序列为模板设计实时荧光定量PCR引物,内参基因选择GAPDH(NM_001034034.2)、UXT(NM_0010....

图2lncFAM200BPCR扩增结果

以牦牛臀肌cDNA为模板,PCR扩增后经电泳检测获得单一目的条带(图2)。测序结果表明,lncFAM200B全长大小为531bp。2.2lncFAM200B序列分析

图3牦牛与普通牛lncFAM200B序列比对结果

利用NCBI-OpenReadingFrameFinder预测lncFAM200B开放阅读框,得到35条预测结果,其中最长的开放阅读框包含174个碱基,编码57个氨基酸,小于一般编码基因的氨基酸数(100aa),而该lncRNA长度大于200nt,说明lncFAM200....

图4lncFAM200B原核表达载体双酶切鉴定

经不同浓度的IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析结果显示(图5),lncFAM200B-28a与阴性对照,即空载pET-28a表达情况一致,相同试验条件下,阳性对照CSN3-28a成功表达25.32ku左右的蛋白(CSN3表达21.58ku蛋白,载体可表达3.74ku蛋....

本文编号：3916592