脂肪酸与PPARy基因互作对奶牛乳腺上皮细胞乳脂肪合成的调节作用及机理

发布时间：2024-03-05 02:24

　　乳脂肪是牛奶的主要营养成分,可以为人类提供营养和能量,因此生产具有足够乳脂肪的优质牛奶是健康食品的发展趋势。然而我国牛奶中乳脂肪的含量普遍偏低,削弱了乳制品在国内外市场的竞争力,因此提高乳产量及乳脂肪含量成为我们亟待解决的问题。奶牛乳脂肪合成的前体物主要是乙酸和p-羟丁酸,还有乳腺从血液摄取的长链脂肪酸,以前的研究主要侧重于脂肪酸对奶牛生产性能的影响,而有关脂肪酸与乳腺乳脂肪合成功能基因相互作用的研究较少。 本课题首先利用qRT-PCR和Western blotting筛选干奶期奶牛、低乳品质奶牛和高乳品质奶牛乳腺组织与乳脂肪合成相关的差异表达基因和差异表达蛋白,作为后续体外实验的评价指标。采用组织块培养法构建奶牛乳腺上皮细胞(DCMECs)模型。DCMECs添加乙酸钠、p-羟基丁酸钠、乙酸钠和p-羟基丁酸钠混合物、软脂酸和硬脂酸,qRT-PCR检测DCMECs脂肪酸摄取、转运、活化相关蛋白基因(CD36、FABP3、ACSL1、ACSS2)、脂肪酸从头合成、去饱和酶基因(ACC、FAS、SCD)、甘油三酯合成酶相关基因(GPAT、AGPAT6、DGAT1)和乳脂肪合成转录调控因子(P...

【文章页数】：150 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
1 前言
    1.1 乳脂肪合成机理
        1.1.1 乳脂肪的组成
        1.1.2 乳脂肪酸的组成
        1.1.3 乳脂肪酸的来源
        1.1.4 乳脂肪合成代谢途径
    1.2 乳脂肪降低理论
        1.2.1 葡萄糖生成-胰岛素理论
        1.2.2 反式脂肪酸理论
        1.2.3 生物氢化作用理论
    1.3. 脂肪合成的转录因子
        1.3.1 固醇调节元件结合蛋白
        1.3.2 过氧化物酶体增殖物激活受体
        1.3.3 肝脏X受体
        1.3.4 乳脂肪合成的转录因子
    1.4 脂肪酸对乳脂肪合成的调节
    1.5 本研究的目的和意义
2 材料与方法
    2.1 实验试剂和仪器
        2.1.1 实验试剂
        2.1.2 实验仪器
    2.2 奶牛乳腺组织乳脂肪合成相关基因和蛋白表达检测
        2.2.1 实验动物选取
        2.2.2 奶牛乳腺组织收集及总RNA提取
        2.2.3 qRT-PCR检测乳脂肪合成相关基因表达
        2.2.4 Western blotting检测乳脂肪合成转录调控因子和相关蛋白表达
    2.3 奶牛乳腺上皮细胞(DCMECs)的原代培养及鉴定
        2.3.1 奶牛乳腺上皮细胞的原代培养及纯化
        2.3.2 奶牛乳腺上皮细胞的鉴定
    2.4 脂肪酸对DCMECs乳脂肪合成影响的检测
        2.4.1 脂肪酸的最佳作用浓度筛选
        2.4.2 脂肪酸作用DCMECs后乳脂肪合成相关基因表达的检测
        2.4.3 脂肪酸作用DCMECs后乳脂肪合成转录因子及相关蛋白表达的检测
        2.4.4 脂肪酸作用DCMECs后乳脂肪合成关键酶活性的检测
    2.5 细胞免疫荧光法进行乳脂肪合成关键转录因子PPARγ定位分析
    2.6 脂肪酸添加对PPARγ基因沉寂DCMECs乳脂肪合成影响的检测
        2.6.1 脂肪酸的最佳作用浓度筛选
        2.6.2 乳脂肪合成相关基因表达的检测
        2.6.3 乳脂肪合成转录因子表达的检测
        2.6.4 乳脂肪合成关键酶活性的检测
    2.7 脂肪酸添加对PPARγ基因超表达DCMECs乳脂肪合成影响的检测
        2.7.1 引物设计及PPARγ基因扩增
        2.7.2 PPARγ基因PCR扩增产物克隆载体构建
        2.7.3 真核表达载体pGCMV/IRES/EGFP/PPARγ的构建
        2.7.4 脂肪酸的最佳作用浓度筛选
        2.7.5 乳脂肪合成相关基因表达的检测
        2.7.6 乳脂肪合成转录因子表达的检测
        2.7.7 乳脂肪合成关键酶活性的检测
    2.8 数据处理
3 结果与分析
    3.1 奶牛乳腺组织乳脂肪合成相关基因和相关蛋白表达检测结果
        3.1.1 奶牛乳腺组织乳脂肪合成相关基因表达结果
        3.1.2 奶牛乳腺组织乳脂肪合成转录调控因子和相关蛋白表达结果
    3.2 奶牛乳腺上皮细胞原代培养及鉴定
    3.3 脂肪酸对DCMECs乳脂肪合成影响的检测结果
        3.3.1 乙酸钠对DCMECs乳脂肪合成影响的检测结果
        3.3.2 β-羟基丁酸钠对DCMECs乳脂肪合成影响的检测结果
        3.3.3 乙酸钠和β-羟基丁酸钠协同作用对DCMECs乳脂肪合成影响的检测结果
        3.3.4 软脂酸对DCMECs乳脂肪合成影响的检测结果
        3.3.5 硬脂酸对DCMECs乳脂肪合成影响的检测结果
    3.4 乳脂肪合成关键转录因子PPARγ定位分析
    3.5 脂肪酸对PPARγ基因沉寂DCMECs乳脂肪合成影响的检测结果
        3.5.1 PPARγ RNA沉寂效率
        3.5.2 乙酸钠对PPARγ基因沉寂DCMECs乳脂肪合成影响的检测结果
        3.5.3 β-羟基丁酸钠对PPARγ基因沉寂DCMECs乳脂肪合成影响的检测结果
        3.5.4 乙酸钠和β-羟基丁酸钠协同作用对PPARγ基因沉寂DCMECs乳脂肪合成影响的检测结果
        3.5.5 软脂酸对PPARγ基因沉寂DCMECs乳脂肪合成影响的检测结果
        3.5.6 硬脂酸对PPARγ基因沉寂DCMECs乳脂肪合成影响的检测结果
    3.6 脂肪酸对PPARγ基因超表达DCMECs乳脂肪合成影响的检测结果
        3.6.1 PPARγ的PCR扩增结果及重组质粒pGCMV/IRES/EGFP/PPARγ的验证
        3.6.2 PPARγ超表达效率
        3.6.3 乙酸钠对PPARγ基因超表达DCMECs乳脂肪合成影响的检测结果
        3.6.4 β-羟基丁酸钠对PPARγ基因超表达DCMECs乳脂肪合成影响的检测结果
        3.6.5 乙酸钠和β-羟基丁酸钠协同作用对PPARγ基因超表达DCMECs乳脂肪合成影响的检测结果
        3.6.6 软脂酸对PPARγ基因超表达DCMECs乳脂肪合成影响的检测结果
        3.6.7 硬脂酸对PPARγ基因超表达DCMECs乳脂肪合成影响的检测结果
    3.7 脂肪酸与PPARγ基因互作对DCMECs乳脂肪合成的调节作用示意图
4 讨论
    4.1 不同泌乳质量奶牛乳腺组织乳脂肪合成相关基因表达和蛋白表达分析
    4.2 脂肪酸对DCMECs乳脂肪合成的影响
        4.2.1 乙酸钠对DCMECs乳脂肪合成的影响
        4.2.2 β-羟基丁酸钠对DCMECs乳脂肪合成的影响
        4.2.3 乙酸钠和β-羟基丁酸钠协同作用对DCMECs乳脂肪合成的影响
        4.2.4 软脂酸对DCMECs乳脂肪合成的影响
        4.2.5 硬脂酸对DCMECs乳脂肪合成的影响
        4.2.6 脂肪酸对DCMECs乳脂肪合成相关基因表达的调节作用
    4.3 PPARγ细胞内定位分析
    4.4 PPARγ基因沉寂和超表达对DCMECs乳脂肪合成的影响
        4.4.1 PPARγ基因沉寂对DCMECs乳脂肪合成的影响
        4.4.2 PPARγ基因超表达对DCMECs乳脂肪合成的影响
    4.5 脂肪酸对PPARγ基因沉寂和超表达DCMECs乳脂肪合成的影响
        4.5.1 乙酸钠对PPARγ基因沉寂和超表达DCMECs乳脂肪合成的影响
        4.5.2 β-羟基丁酸钠对PPARγ基因沉寂和超表达DCMECs乳脂肪合成的影响
        4.5.3 乙酸钠和β-羟基丁酸钠协同作用对PPARγ基因沉寂和超表达DCMECs乳脂肪合成的影响
        4.5.4 软脂酸对PPARγ基因沉寂和超表达DCMECs乳脂肪合成的影响
        4.5.5 硬脂酸对PPARγ基因沉寂和超表达DCMECs乳脂肪合成的影响
5 结论
致谢
参考文献
附录
攻读博士学位期间发表的学术论文



本文编号：3919526