IFN-γ启动子荧光素酶报告系统的建立及其在筛选结核分枝杆菌蛋白调控IFN-γ表达中的应用

发布时间：2024-04-22 03:34

　　结核病是由结核分枝杆菌引起的一种慢性传染病。结核病的疫情仍然非常严重,已成为目前全球最严重的公共卫生问题之一。据WHO估计,全球约有1/3的人感染结核分枝杆菌,2012年有860万新发病例,死亡人数为130万。结核分枝杆菌感染宿主后会引起宿主的免疫应答反应并产生多种细胞因子。其中IFN-γ是抵抗结核分枝杆菌感染最主要的细胞因子。IFN-γ是一种Ⅱ型干扰素主要由活化T细胞、NK细胞产生,能激活巨噬细胞对结核分枝杆菌的清除具有重要意义。因此本实验主要是研究对IFN-γ具有调控作用的结核分枝杆菌蛋白。 1.候选蛋白的选择 本实验以结核分枝杆菌H37Rv株为研究对象筛选出一些可能对IFN-γ具有调控作用的结核分枝杆菌脂蛋白,膜蛋白和分泌蛋白。通过生物信息学方法和结核分枝杆菌蛋白质组学的综合考虑本实验共选取了173个蛋白基因作为候选基因。针对这些蛋白的目的基因序列设计出使引物所带有的酶切位点尽量相同PCR的引物。 2.候选蛋白真核表达质粒的构建 本实验以结核分枝杆菌的基因组DNA为模板进行PCR扩增。然后将克隆得到的目的基因连接至pcDNA3.1-V5/HisB载体中,构建了相关蛋白的真核表达质...

【文章页数】：71 页

【学位级别】：硕士

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摘要
ABSTRACT
缩略语表
第1章 文献综述
    1.1 结核分枝杆菌简介
    1.2 结核分枝杆菌病的诊断和疫苗研究
    1.3 结核分枝杆菌与免疫反应
    1.4 结核分枝杆菌蛋白的研究
    1.5 Gamma干扰素的研究进展
第2章 研究目的和意义
第3章 材料与方法
    3.1 实验材料
        3.1.1 细菌和细胞
        3.1.2 质粒构建所需材料及获赠质粒
        3.1.3 主要试剂
        3.1.4 缓冲液及相关试剂的配制
    3.2 实验方法
        3.2.1 细胞基因组的提取
        3.2.2 候选蛋白基因的引物设计
        3.2.3 候选蛋白基因的PCR扩增
        3.2.4 限制性内切酶酶切反应
        3.2.5 PCR产物或酶切产物的电泳检测
        3.2.6 外源DNA片段与质粒载体的连接反应
        3.2.7 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)
        3.2.8 连接产物的转化
        3.2.9 重组质粒的鉴定
        3.2.10 荧光素酶报告基因实验
        3.2.11 实时定量RT-PCR检测基因mRNA水平
        3.2.12 Western Blot样品制备
        3.2.13 重组蛋白的原核表达和SDS-PAGE分析
        3.2.14 原核表达重组蛋白的纯化
        3.2.15 统计学方法
第4章 结果与分析
    4.1 候选研究蛋白的选取
    4.2 候选蛋白基因真核表达质粒的构建
    4.3 人源IFN-γ启动子荧光素酶报告质粒的构建
    4.4 结核分枝杆菌相关蛋白对IFN-γ调控的筛选
    4.5 结核分枝杆菌Rv0720,Rv3623和Rv3763蛋白原核表达质粒构建及蛋白纯化
    4.6 结核分枝杆菌蛋白对IFN-γ调控的检测
第5章 讨论与结论
    5.1 讨论
    5.2 结论
参考文献
附录一 PCR扩增引物及酶切位点
附录二 调控IFN-γ表达的结核分枝杆菌蛋白的初步筛选
致谢



本文编号：3961868