慢病毒介导稳定表达禽β-防御素9的DF-1细胞系的建立及初步应用

发布时间：2024-05-14 06:01

　　【目的】为建立能够稳定表达禽β-防御素9(AvBD9)的DF-1细胞系,并检测其表达产物对耐药大肠杆菌的抗菌活性。【方法】将AvBD9基因克隆至慢病毒载体pLOV-eGFP中,将重组质粒与psPAX2和pMD2.G共转染293T细胞,包装成含AvBD9基因的重组慢病毒,并将其感染DF-1细胞,通过嘌呤霉素筛选和纯化,获得稳定表达AvBD9蛋白的DF-1细胞系。利用RT-PCR和Western blot验证AvBD9基因在DF-1中的转录和表达;将细胞培养上清液与耐药大肠杆菌混合培养,检测其抗菌效果,并用扫描电镜观察其对菌体的损伤情况。【结果】筛选出了稳定表达AvBD9的DF-1细胞系,且AvBD9在转录水平和蛋白水平均有表达;细胞培养上清使耐药大肠杆菌的存活率低于55%,电镜观察显示菌体皱缩,损伤严重。【结论】成功建立能够稳定表达AvBD9的DF-1细胞系,为抗生素替代品的生产制备提供了借鉴思路,为进一步开展AvBD9的抗菌研究提供依据。

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【部分图文】：

图1pLOV-eGFP载体线性化以及含同源臂的AvBD9基因PCR扩增产物电泳结果

根据材料和方法1.5，将pLOV-eGFP-AvBD9、pSPAX2和pMD2.G质粒共转染293T细胞，24h后，荧光显微镜下观察瞬时转染后绿色荧光信号分布。取293T细胞培养上清液感染DF-1细胞，以1μg/mL嘌呤霉素工作浓度进行细胞筛选后得到细胞多克隆，通过3轮有限稀....

图2慢病毒包装及细胞系筛选结果图

细胞培养上清液与耐药大肠杆菌作用不同时间后读取吸光度，结果显示：随着孵育时间的增加，耐药菌的存活率逐渐降低，孵育5h时多重耐药大肠杆菌的存活率低于55%，但作用6h后，存活率开始上升（图5）。表明AvBD9的抗菌效果同时间具有相关性。同时，扫描电镜检测抑菌活性发现，对照组菌体....

图4AvBD9蛋白Westernblot检测

图2慢病毒包装及细胞系筛选结果图图3DF-1-AvBD9细胞AvBD9基因检测

图3DF-1-AvBD9细胞AvBD9基因检测

图4AvBD9蛋白Westernblot检测图5DF-1-AvBD9细胞培养上清的抗菌活性

本文编号：3973287