表达BRSV主要免疫原性基因G的重组BHV-1病毒构建及其生物学特性研究

发布时间：2024-06-02 04:21

　　牛传染性鼻气管炎(Infectious bovine rhinotracheitis)又称坏死性鼻炎(necrotic rhinitis),是由牛疱疹病毒Ⅰ型(Bovine Herpesvirus 1,BHV-1)感染野生和家养牛引起的一种接触性传染病,呈全球分布,该病可引起上呼吸道感染,其特征为鼻部出现粘液脓涕,口鼻部充血,呼吸困难,以及生殖道感染,结膜炎,流产,乳房炎等多种病症。牛呼吸道合胞病毒(bovine respiratory syncytial virus,BRSV)感染可以引起犊牛呼吸道疾病,也可以与其它病原混合感染引起牛的呼吸道疾病。主要危害是此病感染率高,占牛流行性呼吸道疾病中的60%以上,给养牛业造成了重大的经济损失。鉴于此,本研究以BHV-1基因缺失毒株TK-/gG-/gE-为载体,构建表达BRSV主要免疫原性蛋白G基因的牛BHV-1重组病毒,对其生物学特性、安全性进行了研究。具体研究内容如下:(1)BRSVG蛋白的原核表达将BRSVG基因196-774bp(mG)连入pET-30a原核表达载体,构建重组质粒pET-30a-mG原核表达质粒。转化大肠杆菌BL21表...

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摘要
ABSTRACT
英文缩略表(Abbreviations)
1 文献综述
    1.1 牛呼吸道合胞病毒
    1.2 牛呼吸道合胞病毒编码的蛋白
        1.2.1 非结构蛋白NS1和NS2
        1.2.2 疏水SH小蛋白
        1.2.3 糖蛋白G
        1.2.4 融合F蛋白
    1.3 牛呼吸道合胞病毒的流行病学
    1.4 牛呼吸道合胞病毒疫苗的研究进展
        1.4.1 灭活疫苗
        1.4.2 亚单位合成疫苗
        1.4.3 活病毒疫苗
        1.4.4 病毒载体活疫苗
        1.4.5 DNA疫苗
    1.5 BHV-1病毒的概述
    1.6 BHV-1的流行病学
    1.7 BHV-1病毒活载体疫苗的研究进展
2 研究目的与意义
3 材料与方法
    3.1 实验材料
        3.1.1 菌种、细胞及毒株
        3.1.2 载体与质粒
        3.1.3 工具酶及主要试剂
        3.1.4 主要培养基的配制
        3.1.5 主要缓冲液
            3.1.5.1 质粒提取缓冲液
            3.1.5.2 SDS-PAGE电泳缓冲液
            3.1.5.3 Western blot缓冲液
            3.1.5.4 蛋白纯化缓冲液
        3.1.6 空斑纯化试剂
        3.1.7 ELISA缓冲液
        3.1.8 其他溶液
        3.1.9 本研究所用引物
        3.1.10 试验动物及试验地点
    3.2 实验方法
        3.2.1 病毒增殖
        3.2.2 限制性内切酶酶切反应
        3.2.3 PCR或酶切产物琼脂糖凝胶电泳检测
        3.2.4 PCR或酶切产物的回收与纯化
        3.2.5 外源DNA片段与载体的连接反应
        3.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)
        3.2.7 连接产物的转化
        3.2.8 重组质粒的小量制备(OMEGA质粒小提试剂盒)
        3.2.9 重组质粒的大量制备(OMEGA质粒大提试剂盒)
        3.2.10 诱导表达
        3.2.11 表达蛋白的分析和纯化
        3.2.12 表达蛋白的多抗制备
        3.2.13 间接ELISA确定表达蛋白的最佳包被浓度
        3.2.14 病毒基因组的大量提取
        3.2.15 脂质体介导的共转染
        3.2.16 空斑挑取及纯化
        3.2.17 病毒基因的小量提取
        3.2.18 病毒基因组PCR鉴定
        3.2.19 间接免疫荧光试验(IFA)检测目的蛋白的表达
        3.2.20 Western blot检测目的蛋白的表达
            3.2.20.1 样品的处理
            3.2.20.2 SDS-PAGE电泳
            3.2.20.3 Western blot检测
        3.2.21 病毒TCID50的测定
        3.2.22 一步法增殖曲线
        3.2.23 动物试验
            3.2.23.1 重组牛疱疹病毒BHV-1TK^-/gG^-/gE^-/BRSVG⁺的动物试验
            3.2.23.2 动物试验鼻拭子的检测
            3.2.23.3 动物试验血清ELISA抗体检测
            3.2.23.4 动物试验血清中和抗体检测
4 结果与分析
    4.1 BRSV G基因的原核表达以及间接ELISA抗原最佳包被浓度的确定
        4.1.1 原核表达质粒pET-30a-mG的构建
        4.1.2 BRSV mG蛋白的原核表达
        4.1.3 mG蛋白的纯化
        4.1.4 mG蛋白的westernblot鉴定
        4.1.5 兔多抗的制备及检测
        4.1.6 mG-ELISA检测确定mG蛋白的最佳包被浓度
    4.2 重组病毒BHV-1TK^-/gG^-/gE^-/BSRVG⁺的构建
        4.2.1 中间转移载体pSK-b actin-BGH-CMV-SV40的构建
        4.2.2 转移载体pSKBgEpCA.G的构建
        4.2.3 重组病毒BHV-1TK^-/gG^-/gE^-/BSRVG⁺的构建与初步鉴定
        4.2.4 重组病毒BHV-1 TK^-/gG^-/gE^-/BRSVG⁺的PCR鉴定与空斑纯化
        4.2.5 重组病毒BHV-1 TK^-/gG^-/gE^-/BRSVG⁺外源基因表达的检测
            4.2.5.1 重组病毒BHV-1 TK^-/gG^-/gE^-/BRSVG⁺的间接免疫荧光检测
            4.2.5.2 重组病毒BHV-1 TK^-/gG^-/gE^-/BRSVG⁺的western blot检测
        4.2.6 重组病毒BHV-1 TK^-/gG^-/gE^-/BRSVG⁺的遗传稳定性检测
        4.2.7 重组病毒BHV-1 TK^-/gG^-/gE^-/BRSVG⁺一步法生长曲线
    4.3 重组病毒BHV-1 TK^-/gG^-/gE^-/BRSVG+免疫原性的初步研究
        4.3.1 兔鼻拭子的排毒情况检测
        4.3.2 ELISA检测兔血清中的BRSV抗体水平
        4.3.3 中和试验检测兔血清中的BHV-1中和抗体水平
5 讨论与结论
    5.1 讨论
        5.1.1 BRSV.G蛋白的表达
        5.1.2 疱疹病毒Ⅰ型载体的选择
        5.1.3 重组病毒的构建和动物实验
    5.2 结论
参考文献
致谢



本文编号：3986847