兔源强毒力金黄色葡萄球菌双重PCR检测方法的建立

发布时间：2024-06-02 20:39

　　【目的】建立检测兔源强毒力金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的双重PCR检测方法,为兔葡萄球菌病的诊断提供技术支持。【方法】根据兔源金黄色葡萄球菌的nuc和pvl两种毒力基因的保守序列分别设计了两对特异性引物进行双重PCR扩增,对双重PCR反应体系的混合引物浓度和退火温度进行优化,对双重PCR检测方法的特异性、敏感性和准确性进行验证。【结果】当双重PCR反应体系混合引物的浓度为0.6μmol·L-1、退火温度为59.6℃时,双重PCR的扩增效果最优。该双重PCR检测方法特异性好,能扩增出兔源强毒力金黄色葡萄球菌的nuc(320 bp)和pvl(585 bp)基因片段以及低毒力菌株的nuc(320 bp)基因片段,对兔源多杀性巴氏杆菌、支气管败血波氏杆菌、肺炎克雷伯菌和大肠杆菌等4种常见兔源细菌性病原菌以及阴性对照均无交叉反应。该方法敏感性高,能分别检出10 pg和100 fg的强毒力和低毒力兔源金黄色葡萄球菌基因组DNA。该方法重复性好,批内和批间重复性试验的变异系数均为0;该方法准确性好,对119份临床样品的检测结果与已报道的检测金黄色葡萄球菌nuc和pvl...

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【部分图文】：

图1单重PCR扩增结果

将强毒力菌株或低毒力菌株基因组DNA的量固定为100ng进行双重PCR扩增，结果表明混合引物浓度为0.4μmol·L-1、退火温度为58℃时能分别扩增出强毒力菌株的nuc和pvl基因片段和低毒力菌株的nuc基因片段（图2）。在此基础上，进一步对反应体系中混合引物的浓度和退火温度....

图3双重PCR检测方法引物浓度优化

图2双重PCR扩增结果图4双重PCR检测方法退火温度优化

图4双重PCR检测方法退火温度优化

图3双重PCR检测方法引物浓度优化2.3双重PCR检测方法的特异性

图5双重PCR检测方法特异性

应用建立的双重PCR方法检测3组已知结果的样品（每组20份，共60份），重复3次，结果显示，重复性试验批内和批间的变异系数均为0，表明该双重PCR方法具有良好的重复性。图6双重PCR检测方法敏感性

本文编号：3987750