塔里木马鹿茸间充质干细胞软骨诱导分化及c-myc基因的表达

发布时间：2017-05-27 04:11

  本文关键词：塔里木马鹿茸间充质干细胞软骨诱导分化及c-myc基因的表达，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：鹿茸在我国中医药典中是珍贵的中医药材,具有较高的经济价值,其快速生长和割后再生的特点是哺乳动物器官中独有的,成为国内外研究的热点。c-myc基因是原癌基因家族中的一种转录因子,研究发现在很多癌症组织中上调表达,对正常组织细胞具有调控增殖、分化和细胞凋亡等多种功能,塔里木马鹿是新疆南部地区重要的经济动物之一,以塔里木马鹿茸为材料研究其间充质干细胞(MSCs)培养模式及细胞的生物学特性,建立鹿茸MSCs体外软骨分化模型为鹿茸生长发育的研究和人类软骨发育及骨疾病研究提供基础;同时研究体外诱导MSCs软骨分化过程中c-myc基因的表达特征,为鹿茸快速生长机制的研究提供理论支持。1、实验利用酶消化法和组织块法相结合成功获得鹿茸MSCs,体外培养的组织块1d贴壁,2 d后有细胞迁出,6 d时细胞数量达到高峰。传代培养的2-6代细胞在培养到4 d时细胞增殖达到高峰。原代培养细胞呈梭形,细胞核呈椭圆形,细胞呈菊花状排列生长;传代细胞形态呈梭形,排列无规则。5%的二甲基亚砜作为冷冻液可将细胞冷冻时间达到30 d以上且不影响其复苏和生长。2、在培养液中加入10 ng/mL TGFβ1、10~（-7） M地塞米松和50μg/mL抗坏血酸作为诱导培养基,成功体外诱导鹿茸MSCs向软骨分化,结果显示,在诱导第7 d的细胞开始少量表达Ⅱ型胶原基因(Co LⅡ),但是未检测到蛋白的表达。从诱导14 d至21 d细胞CoLⅡ表达量增加,阿利新蓝和甲苯胺蓝染色鉴定蛋白多糖结果逐渐达强阳性。在诱导21 d可获得软骨样细胞,细胞CoLⅡ的表达显著高于其他诱导天数的细胞(p0.05),免疫组化鉴定胞外Ⅱ型胶原蛋白的量呈阳性。诱导28 d的细胞CoLⅡ的表达量降低,Ι型胶原(CoLΙ)的表达量显著增高(p0.05),胞外蛋白多糖积累量开始下降,茜素红鉴定细胞Ca~（2+）分泌结果呈阳性,说明细胞进入肥大成熟期,之后开始向骨细胞分化;诱导35 d的细胞CoLⅡ和CoLΙ的表达量均降低,胞外蛋白多糖积累量达到最低,Ca~（2+）和胶原量显著高于其他诱导天数的细胞(p0.05)。3、在诱导鹿茸MSCs向软骨分化过程中,c-myc基因整体呈下调表达,在诱导7 d的细胞c-myc表达量最高,之后随诱导时间逐渐下调表达至21 d达到最低,之后虽有上升趋势但与第7 d的表达量相比没有显著差异。综上所述,10 ng/mL TGFβ_1可成功诱导塔里木马鹿茸间充质干细胞向软骨细胞分化,分化后的细胞具有分泌软骨标志物的功能。初步认为细胞软骨分化过程中c-myc的下调表达诱导了鹿茸MSCs软骨分化的发生。
【关键词】：塔里木马鹿 鹿茸 间充质干细胞(MSCs) 诱导分化 c-myc基因
【学位授予单位】：塔里木大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S825
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 前言10-11
• 第1章 文献综述11-21
• 1.1 新疆塔里木马鹿概述11-13
• 1.2 鹿茸13-15
• 1.2.1 鹿茸的生长特点13-14
• 1.2.2 鹿茸快速生长的研究进展14-15
• 1.3 鹿茸间充质干细胞（MSCs）15-16
• 1.4 原癌基因c-myc16-18
• 1.5 实验技术18-19
• 1.5.1 细胞培养技术18-19
• 1.5.2 荧光定量PCR技术19
• 1.6 研究目的意义19-21
• 第2章 塔里木马鹿茸间充质干细胞（MSCs）的体外培养21-30
• 2.1 材料与方法21-25
• 2.1.1 实验样品来源21-22
• 2.1.2 主要仪器22
• 2.1.3 主要试剂22
• 2.1.4 溶液配制22-23
• 2.1.5 实验方法23-25
• 2.2 结果与分析25-28
• 2.2.1 原代培养25-26
• 2.2.2 细胞传代培养26
• 2.2.3 细胞冻存和复苏26-27
• 2.2.4 细胞爬片HE染色27
• 2.2.5 生长曲线的分析27-28
• 2.3 讨论28-29
• 2.4 小结29-30
• 第3章 体外诱导塔里木马鹿茸MSCs软骨分化的实验研究30-49
• 3.1 材料与方法31-36
• 3.1.1 主要材料31
• 3.1.2 实验方法31-36
• 3.1.3 统计分析36
• 3.2 结果与分析36-46
• 3.2.1 不同诱导组细胞形态学观察36-37
• 3.2.2 细胞RNA提取37
• 3.2.3 不同诱导剂下鹿茸MSCs软骨分化的CoLⅡ和CoLⅠ的相对表达37-39
• 3.2.4 诱导分化不同阶段5种方法的检测结果39-46
• 3.3 讨论46-48
• 3.3.1 诱导细胞和条件的筛选46
• 3.3.2 鹿茸MSCs软骨分化过程中CoLⅡ和Ca~（2+）分泌变化特征46-48
• 3.3.3 鹿茸MSCs软骨分化过程中蛋白多糖分泌的变化特征48
• 3.4 小结48-49
• 第4章 塔里木马鹿茸MSCs软骨分化过程中c-myc基因的表达变化49-53
• 4.1 材料与方法49-50
• 4.1.1 仪器与试剂49
• 4.1.2 实验方法49-50
• 4.2 结果50-51
• 4.2.1 细胞c-myc基因在诱导分化过程中的相对表达结果50-51
• 4.3 讨论51-52
• 4.4 小结52-53
• 结论53-54
• 参考文献54-63
• 附录63-65
• 致谢65-66
• 作者简介66

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本文编号：398806