FDFT1基因shRNA和过表达载体的构建及对牛胎儿成纤维细胞胆固醇代谢的影响

发布时间：2024-06-04 04:55

　　FDFT1基因(Farnesyl-Diphosphate Farnesyltransferase 1),法尼基二磷酸法尼基转移酶1)是胆固醇代谢通路中的重要基因。为进一步研究FDFT1基因在胆固醇代谢和脂质代谢中的作用,本研究构建了带有绿色荧光标记的FDFT1基因shRNA干扰载体以及过表达载体,将其转染牛胎儿成纤维细胞(Bovine Fetal Fibroblasts,BFF),采用荧光定量PCR和Western blot的方法,检测FDFT1基因mRNA和蛋白的表达水平,在细胞水平验证了shRNA干扰载体的干扰效率和过表达载体的有效性。使用成功构建的载体干扰或是过表达FDFT1基因后,对FDFT1基因所在通路的上下游、胆固醇生物合成、胆固醇代谢和胆固醇转运相关基因的表达量分析,更深层次揭示了FDFT1基因在胆固醇合成、代谢和转运间的作用。通过对胆固醇和甘油三酯的含量测试也可以了解到FDFT1基因在脂质代谢中的作用。结果表明,shRNA组FDFT1-Bos-520的FDFT1基因mRNA表达水平降低至shRNA NC组的40.7%(p<0.01),蛋白质表达水平降低至shRNA...

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【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图1.1pGPUU6-GFP-Neo的载体图谱谱

养间中将配安全柜的取出牛胎的冻存管的冻存管液，加入好培养基的间和细胞信仍然半个好2mL水图1.1pGPUFig.1.1p配置好的培养的紫外灯和细胎儿成纤维细管放入离心机管使用75%入培养基1m的细胞培养信息，放入个小时紫外消水浴预热的U6-GFP-NeoGPU6-G....

图1.2BFMorphologyan荧光（40×），BFF转染24hndGreenFlu是相同视野下后细胞形态

避曝细染以cD进光孵育2h曝光照相同时胞荧光结果染24h时通上可以进行DNA后进行进行后续的相。TBST漂时测试灰度果通过荧光显行后续的实行荧光定量相关实验。漂洗2次，度值，结果如微镜观察的实验分析。对量检测FDFT每次5m如图1.6。的结果见图对转....

图2ig.2.2Result2.2FDFT1基sofPCRamp基因CDS区plificationofPCR扩增结fFDFT1gene结果

凝胶电泳检测一致，如图2.2FDFT1基sofPCRampMarkerD2000行2%琼262.2配置反转后，分装标gDNA去除反NAremovalre使用量2计算好补足12反转录反应etranscriptio使用量212补足基因过表达后.2.6，结果....

图2.3胶回nofqualityfo回收后DNAorrecoveringA质量检测DNAfromggelelectrophooresis

2.3DetectionpBI-CMV琼脂糖凝上与预期线性化后2.4pBI-CExaminingp图2.3胶回nofqualityfo1、V3-FDFT1构凝胶电泳检期FDFT1基后的片段长CMV3-FDFT1pBI-CMV3-F回收后DNAorrec....

本文编号：3988896