体细胞核移植技术制备转GH基因奶山羊的研究

发布时间：2024-10-02 20:34

　　全世界有190多个国家饲养奶山羊,我国是奶山羊存栏量最多的国家。但我国奶山羊个体的年均奶产量普遍偏低。如何改良奶山羊品种,提高奶山羊的个体产奶量已成为畜牧工作者亟需解决的问题。生长激素(growth hormone, GH)在乳腺发育和泌乳过程中发挥着重要作用。GH不仅可以促进乳腺发育,而且能维持泌乳期乳腺上皮细胞的数量,进而增加奶产量。因此,本研究选用GH作为目的基因,通过体细胞核移植技术培育高产奶量的转基因奶山羊新品种。首先,通过分子克隆技术,利用p-LG基因启动子元件构建能够在乳腺中特异性表达GH的载体pcGH,然后将载体转染到分离培养纯化的乳腺上皮细胞中,验证该载体能在体外分离的乳腺上皮细胞中表达GH；其次,采用电转染的方法将线性化的载体pcGH转染到分离培养的山羊胎儿成纤维细胞中,通过G418药物筛选转GH基因阳性细胞。进一步将转GH基因阳性细胞移植到去核的卵母细胞中,经融合激活待其发育到囊胚或桑椹胚后,移植到代孕母羊子宫中生产F0代克隆奶山羊；再次,通过普通PCR、Southern-blot、荧光定量PCR和TAIL-PCR等技术方法检测了外源基因在FO代克隆羊基因组中的整合...

【文章页数】：137 页

【学位级别】：博士

【部分图文】：

图１－２?ＴＡＬＥ核酸酶二聚体结合ＤＮＡ示意图??Ｆｉｇｕｒｅ?１－２?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ａ?ＴＡＬＥ?ｎｕｃｌｅａｓｅ?（ＴＡＬＥＮ）?ｄｉｍｅｒ?ｂｏｎｄｉｎ呂化?ＤＮＡ??

构建一对由ＤＮＡ识别域和一个非特异性核酸内切酶仍ＡＩ组成的二聚体。进而对??靴序列ＤＮＡ进行切割，形成ＤＮＡ双链断裂（Ｄｏｕｂｌｅ?ｓｔｒａｎｄ?ｂｒｅａｋ，ＤＳＢ）。之后再借??助于同源重组机制实现定点敲除或插入（图１－２）。相比ＺＦＮ技术，新出现的ＴＡＬＥ??的结构域能够识别....

图１－３?ＲＮＡ介导的Ｃａｓ９系统定向基因组修饰??

个Ｃａｓ蛋白就能使ｃｒＲＮＡ成熟、靴向核酸、剪切ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａ巧的剪切位点位于??ｃｒＲＮＡ?下游互补序列?ＰＡＭ?区（Ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ－ａｄｊａｃｅｎｔ?ｍｏｔｉｆ）的?５’－ＧＧ－Ｎ１８－ＮＧＧ－３’特征??区域的ＮＧＧ位点，这＾特征序列每１２８个碱基中重复化现一次....

图２－１?ＧＨ介导的信号通路途径??Ｆｉｇｕｒｅ?２－１?Ｇｒｏｗｔｈ?ｈｏｒｍｏｎｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ?ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ?ｓｉｇｎａｌｉｎｇ?ｐａｔｈｗａｙｓ??３?ＧＨ的生物学功能??

图２－１?ＧＨ介导的信号通路途径??Ｆｉｇｕｒｅ?２－１?Ｇｒｏｗｔｈ?ｈｏｒｍｏｎｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ?ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ?ｓｉｇｎａｌｉｎｇ?ｐａｔｈｗａｙｓ??物学功能??物的生长??一种促生长因子，最早发现的功能就是刺激动物生长。作节因子。ＧＨ能刺激所有机体组织的....

图３－３?ＰＣ民扩增ｐ－ＬＧ?５’端和３’端调控序列??

穗通：??６娜；墨－身一Ｔ誦評ｈ?；Ｍｈ。??［；—．—一；＇ｙ若山?？已?Ｉ??图３－２?ＲＴ－ＰＣ民扩增如基因??１，２，３，４：?ＰＣ民产物；ＣＫ：阴性对照；Ｍ：?ＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒ??Ｆｉｇｕｒｅ?３－２?Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ＧＨ?ｇｅｎｅ?ｂｙ?ＲＴ....

本文编号：4006335