猪瘟病毒E2蛋白纳米抗体的筛选及活性鉴定

发布时间：2017-06-03 17:01

  本文关键词：猪瘟病毒E2蛋白纳米抗体的筛选及活性鉴定，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的一种以严重出血和高热为特征的高度接触性传染病。猪瘟可导致猪群大规模发病和死亡,流行于世界许多国家,给全球养猪业造成了巨大经济损失,并且严重威胁猪相关产品贸易,是危害养猪业最主要的传染病之一,被世界动物卫生组织列为法定报告疫病。CSFV在分类上属于黄病毒科瘟病毒属,其基因组由一条单股正链RNA组成,长约12 kb,编码一个多聚蛋白前体,此多聚蛋白在宿主细胞和病毒自身蛋白酶的作用下,可裂解和加工为12种成熟蛋白,其中C、Erns、E1和E2为结构蛋白,其余8种均为非结构蛋白。E2蛋白位于成熟病毒粒子的囊膜上,不仅与病毒吸附和入侵宿主有密切关系,而且也是诱导猪体产生免疫保护的最主要抗原蛋白。因此,E2蛋白是设计和开发抗CSFV疫苗、诊断试剂的理想靶标。虽然已有多株E2蛋白的单克隆抗体被筛选出来,并且在诊断领域得到了应用,但是目前仍未见CSFV E2蛋白纳米抗体的报道,并且常规单克隆抗体的制造成本较高,为降低诊断治疗试剂的成本以及为CSFV研究提供新的工具,开发新的廉价抗CSFV抗体很有必要。纳米抗体(Nanobodies,Nbs)衍生于骆驼体内存在的重链抗体,是目前已知天然存在的最小抗体片段。由于纳米抗体相对较长的CDR3区以及FR2区特征性亲水性氨基酸的存在,使其在具备分子量小的优势的同时,又兼具高亲和力、高可溶性、容易制造和表达、且可识别常规抗体不能识别的表位等优点,是诊断和治疗性生物试剂设计的理想候选体。本研究以E2蛋白为诱饵,利用酵母双杂交技术对前期实验室构建的纳米抗体文库进行了筛选,并对筛选出的纳米抗体进行了表达和初步的活性鉴定。主要内容如下:(1)根据GenBank中公布的CSFV C株序列,设计引物扩增出缺失跨膜区E2基因,成功构建pGBKT7-E2诱饵质粒,并对质粒的自激活活性和毒性进行了检测。结果表明E2蛋白在酵母细胞内无毒性和自激活能力,可用于酵母双杂交的筛选。利用此诱饵对纳米抗体酵母双杂交文库进行筛选后,成功获得8株阳性克隆。(2)将筛选的阳性克隆序列克隆至原核表达载体pET28a-SUMO,构建了纳米抗体原核表达载体;对纳米抗体进行诱导表达,优化表达条件,结果显示纳米抗体在30℃、IPTG浓度为0.6 mmol/L下诱导8 h表达量最佳;同时也构建了E2蛋白的原核表达载体pMal-c2X-E2,转化Rosetta感受态细胞后,成功诱导表达和纯化了E2蛋白。(3)通过间接ELISA、Western Blot和Dot Blot对表达纯化的纳米抗体活性进行了初步的鉴定。ELISA结果表明筛选出的纳米抗体可与CSFV反应,且反应活性显著高于阴性对照(P0.05)。Western Blot和Dot Blot结果显示表达纯化的8株纳米抗体可特异性地与E2蛋白反应。
【关键词】：猪瘟病毒 纳米抗体 酵母双杂交 E2蛋白
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.4
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-11
• 文献综述11-25
• 第一章 绪论11-25
• 1.1 猪瘟病毒研究进展11-15
• 1.1.1 猪瘟病毒的形态及理化特性11-12
• 1.1.2 CSFV基因组12
• 1.1.3 猪瘟病毒致病机理12-13
• 1.1.4 猪瘟病毒E2蛋白13-14
• 1.1.5 猪瘟病毒的防治14-15
• 1.2 纳米抗体的研究进展15-20
• 1.2.1 纳米抗体的发现16
• 1.2.2 纳米抗体结构16-18
• 1.2.3 纳米抗体特点18-19
• 1.2.4 纳米抗体的应用19-20
• 1.3 酵母双杂交系统20-24
• 1.3.1 酵母双杂交系统20-21
• 1.3.2 文库筛选方法21-22
• 1.3.3 酵母双杂技系统的应用22-23
• 1.3.4 酵母双杂交系统的优缺点23-24
• 1.4 本研究目的意义24-25
• 试验研究25-47
• 第二章 CSFV E2蛋白纳米抗体的筛选25-33
• 2.1 材料25
• 2.2 方法25-28
• 2.2.1 pGBKT7-E2诱饵质粒的构建25-27
• 2.2.2 诱饵质粒的毒性及自激活鉴定27
• 2.2.3 文库筛选27-28
• 2.3 结果与分析28-30
• 2.3.1 重组诱饵质粒的构建28
• 2.3.2 诱饵质粒的毒性及自激活鉴定28-29
• 2.3.3 文库筛选29
• 2.3.4 序列分析29-30
• 2.4 讨论30-32
• 2.5 小结32-33
• 第三章 CSFV E2蛋白及其纳米抗体的原核表达与纯化33-43
• 3.1 材料33
• 3.2 方法33-37
• 3.2.1 CSFV E2蛋白的表达及纯化33-35
• 3.2.2 纳米抗体的表达与纯化35-37
• 3.3 结果与分析37-41
• 3.3.1 pMal-c2X-E2重组表达载体的构建37-38
• 3.3.2 E2蛋白的表达与纯化38
• 3.3.3 pET28a-SUMO-VHH重组表达载体的构建38-39
• 3.3.4 VHH的表达及其表达条件的优化39-41
• 3.3.5 VHH的纯化41
• 3.4 讨论41-42
• 3.5 小结42-43
• 第四章 CSFV E2蛋白纳米抗体活性检测43-47
• 4.1 材料43
• 4.2 方法43-44
• 4.2.1 间接ELISA43
• 4.2.2 Western blot43-44
• 4.2.3 Dot blot44
• 4.3 结果44-46
• 4.3.1 间接ELISA44-45
• 4.3.2 Western blot45
• 4.3.3 Dot blot45-46
• 4.4 讨论46
• 4.5 小结46-47
• 结论47-48
• 参考文献48-55
• 附录55-59
• 致谢59-60
• 作者简介60

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