抗禽传染性支气管炎病毒活性植物的筛选及其作用机制初探

发布时间：2017-06-12 14:12

  本文关键词：抗禽传染性支气管炎病毒活性植物的筛选及其作用机制初探，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：为了筛选出具有抗病毒活性的植物,本文以经人工嵌合荧光素酶基因的禽传染性支气管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus, IBV)为供试病毒,人类肺癌细胞H1299细胞为宿主细胞,对采自鄂西山区分属于21科27属的28种植物(包括8种中国特有植物,9种珍稀植物)甲醇提取物进行了抗病毒活性测定,并明确活性植物的抗病毒机制。分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇对活性植物的甲醇浸提物进行萃取得到石油醚萃取物、氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水溶物5种萃取物,并对各萃取物进行抗病毒活性测定。本试验所选用的供试病毒是通过反向遗传操作,在IBV全基因组的基础上,用荧光素酶luciferase的基因序列替代IBV的非功能基因3ab片段,该病毒能够成功侵染人类肺癌细胞(H1299细胞),并且遗传稳定性与IBV相近,其增殖过程中能融合表达荧光素酶,根据融合蛋白荧光素酶的表达量,来反应病毒的增殖情况,从而检测各植物对IBV的抑制活性。现将主要研究结果总结如下：1、28种植物的甲醇浸提率本文采用冷浸法对采自鄂西山区的28种植物进行甲醇浸提,用旋转蒸发仪减压浓缩得到各植物的甲醇提取物,对各提取物称重并计算其提取率。结果表明,在同等条件下,中华抱茎蓼Polygonum amplexicaule D. Don var. sinense Forb. et Hemsl. ex Stew的甲醇提取率最高,为52.43%；石海椒Reinwardtia indica Dum的甲醇提取率最低,仅为3.75%。2、28种植物甲醇浸提物的抗IBV活性1)植物甲醇浸提物对H1299细胞的毒性试验本试验采用细胞形态观察法,分别于药剂处理24h和48h后通过倒置显微镜观察H1299细胞的形态变化,确定各供试植物甲醇浸提物的H1299细胞最高无毒浓度。结果表明,海金沙L. japonicum甲醇浸提物对H1299细胞的无毒浓度最高,为7×10-Sg/mL,而八角莲D. versipellis甲醇浸提物对H1299细胞的无毒浓度最低,为5×10-8g/mL。表明海金沙L. japonicum甲醇浸提物对H1299细胞的毒性最低,而八角莲D. versipellis甲醇浸提物对H1299细胞的毒性最高。2)28种植物甲醇浸提物的抗IBV活性本试验采用荧光值法对28种植物的抗病毒活性进行测定,试验结果表明,大花还亮草Delphinium anthriscifolium、钝叶楼梯草Elatostema obtusum Wedd、海金沙Lygodium japonicum (Thunb.) Sw.、裸芸香Psilopeganum sinense Hemsl和陕西羽叶报春Primula filchnerae Knuth、湖北大戟Euphorbia hylonoma Hand.-Mazz和天师栗Aesculus wilsonii Rehd等7种植物甲醇提取物表现出不同程度的抗IBV活性,其中大花还亮草、海金沙和裸芸香的抑制率最高,均为99.97%。3、大花还亮草、海金沙和裸芸香甲醇浸提物的抗IBV作用机制本试验采用荧光值法对大花还亮草D. anthriscifoliu、海金沙L. japonicum和裸芸香P. sinense 3种植物甲醇浸提物的抗IBV作用机制进行研究。于IBV感染H1299细胞前用萃取物处理IBV,结果表明,大花还亮草、海金沙和裸芸香3种植物甲醇提取物均能抑制IBV感染H1299细胞,其抑制率分别是98.74%、98.65%和91.41%。于IBV感染H1299细胞前用萃取物处理细胞,结果表明,大花还亮草甲醇提取物促进H1299细胞抗IBV感染的活性最高,抑制率为99.89%;海金沙甲醇提取物次之,抑制率为79.01%；裸芸香甲醇提取物最低,抑制率为68.44%。于IBV感染H1299细胞后用萃取物处理被IBV感染的H1299细胞,结果表明,海金沙甲醇浸提物抑制IBV在H1299细胞内的复制活性最好,抑制率为91.49%。但是,裸芸香甲醇提取物和大花还亮草甲醇提取物不表现抑制IBV在H1299细胞内复制的活性。4大花还亮草、海金沙和裸芸香各萃取物的抗IBV活性试验本试验分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇对大花还亮草D. anthriscifoliu、海金沙L. japonicum和裸芸香P. sinense 3种植物的甲醇浸提物进行萃取,分别得到3种植物的石油醚萃取物、氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水溶物,以IBV为供试病毒,H1299细胞为宿主细胞,对各萃取物的抗病毒活性进行测定。于IBV感染H1299细胞前用萃取物处理H1299细胞,结果表明,大花还亮草水溶物不表现促进H1299细胞抗IBV感染的活性,氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物、石油醚萃取物和正丁醇萃取物均具有促进H1299细胞抗IBV感染的活性,其对IBV的抑制率分别为98.63%,72.15%,50.27%和19.90%。于IBV感染H1299细胞前用萃取物处理IBV,结果表明,大花还亮草各萃取物均具有不同程度的抑制IBV感染H1299细胞活性,从高到低依次是乙酸乙酯萃取物、石油醚萃取物、氯仿萃取物、正丁醇萃取物和水溶物,其抑制率分别为99.96%、99.96%、99.94%、97.90%和87.96%。与大花还亮草各萃取物处理的结果不同,海金沙各萃取物均具有不同程度的抗IBV活性。于IBV感染H1299细胞前用萃取物处理H1299细胞,石油醚萃取物、氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水溶物均表现出促进H1299细胞抗IBV感染的活性,其对IBV的抑制率分别为99.61%、84.87%、46.95%、34.46%和17.03%。于IBV感染H1299细胞前用萃取物处理IBV,海金沙石油醚萃取物、氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水溶物对IBV感染H1299细胞的抑制率分别为99.96%、99.96%、97.56%、70.76%和73.69%。于IBV感染H1299细胞前用萃取物处理IBV,除水溶物外,裸芸香各萃取层抑制IBV感染H1299细胞的活性均较高,其抑制率均达99%以上。因此,大花还亮草甲醇提取物促进H1299细胞抗IBV感染的活性成分主要分布于氯仿层,其次是乙酸乙酯层和石油醚层：具有抑制IBV感染H1299细胞的活性成分主要分布于乙酸乙酯层、石油醚层和氯仿层,正丁醇层和水层也有少许分布。海金沙甲醇提取物中能促进H1299细胞抗IBV感染的活性成分主要分布于氯仿萃取层,其次是石油醚萃取层：具有抑制IBV感染H1299细胞的活性成分主要分布于石油醚层和氯仿层,乙酸乙酯层、正丁醇层和水层也有少于分布。裸芸香甲醇提取物抑制IBV感染H1299细胞的活性成分主要分布于正丁醇层和石油醚层,其次是乙酸乙酯层和氯仿层,水层也有少许分布。
【关键词】：禽传染性支气管炎病毒 抗病毒活性 大花还亮草 海金沙 裸芸香
【学位授予单位】：长江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S853.7
【目录】：

• 摘要4-7
• Abstract7-12
• 第1章 绪论12-21
• 1.1 引言12-13
• 1.2 禽传染性支气管炎病毒(IBV)的研究进展13-14
• 1.3 抗病毒植物的研究进展14-19
• 1.4 本研究的目的及意义19-21
• 第2章 28种植物的采集及活性成分的提取21-29
• 2.1 材料与方法22-24
• 2.2 结果与分析24-27
• 2.3 小结与讨论27-29
• 第3章 28种植物甲醇提取物的抗IBV活性测定29-42
• 3.1 材料与方法30-34
• 3.2 结果与分析34-41
• 3.3 小结与讨论41-42
• 第4章 海金沙等3种植物甲醇提取物的抗IBV作用机制42-48
• 4.1 材料与方法43-46
• 4.2 结果与分析46-47
• 4.3 小结与讨论47-48
• 第5章 海金沙等3种植物甲醇浸提物的萃取及萃取物的抗IBV活性48-60
• 5.1 材料与方法49-53
• 5.2 结果与分析53-59
• 5.3 小结与讨论59-60
• 第6章 结论与展望60-62
• 6.1 结论60-61
• 6.2 展望61-62
• 参考文献62-72
• 致谢72-73
• 个人简介73-74

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