环丙沙星压力下鼠伤寒和肠炎沙门菌的适应性研究

发布时间：2017-06-18 13:10

  本文关键词：环丙沙星压力下鼠伤寒和肠炎沙门菌的适应性研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：非伤寒沙门菌是最常见的食源性和水源感染的重要病原菌。随着多重耐药菌株的出现和日益增多,耐药菌可随着食物链从动物扩散到人类,对人类健康和公共卫生造成严重的威胁。氟喹诺酮类药物因其独特的抗菌机理和广谱的抗菌疗效,被用作治疗沙门菌感染的首选药物。然而随着这类药物的长期和广泛使用,其耐药性也随之快速产生,成为临床治疗的极大负担。本实验室前期流行病学调查研究表明,养殖场普遍流行的沙门菌优势血清型为鼠伤寒型,且表现出对氟喹诺酮类、头孢菌素类等药物的多重耐药表型。因此在耐药发展过程中,优势血清型沙门氏菌是否具有低适应性代偿而得以普遍流行并在环境中持续存在?为了解释这一现象,本研究筛选了从养殖场分离到的两种(鼠伤寒型和肠炎型)血清型沙门菌,在不同环丙沙星压力下进行诱导获得逐步耐药突变株,从耐药发展过程、菌株的生长能力、不同血清型菌株间的竞争能力、及在不同浓度胆盐胁迫下菌株的生存能力和侵袭能力等几个方面来探讨这两种血清型的沙门菌在环丙沙星选择压力下的适应性差异。在不同培养条件下,逐步筛选出耐环丙沙星的鼠伤寒和肠炎型沙门菌的突变株。采用二倍琼脂稀释法测定各突变株的MIC,并且采用PCR的方法检测喹诺酮类药物作用靶位基因gyrA、gyrB、parC、parE的突变。结果显示这两种血清型的亲本株都没有发生QRDR的突变。LB培养条件下进行诱导后发现,肠炎型沙门菌表现对环丙沙星敏感性降低时(MIC,0.125 mg/L),gyr B发生S464F突变,在高水平耐药时(MIC,32mg/L)又增加了gyrA的D87A与parE的V461G突变。M9培养条件下进行诱导,肠炎型沙门菌表现对环丙沙星敏感性降低时(MIC,0.125 mg/L)gyrB出现S464F突变,但是高水平耐药时(MIC,32mg/L)又增加了gyrA的S83F的突变;对于鼠伤寒沙门菌,在LB培养条件下,当诱导出现对环丙沙星敏感性降低表型时,gyrA发生G81D的突变,进一步诱导后环丙沙星的MIC达到16mg/L,在parC额外增加了G78D的突变,随后该突变位点消失,环丙沙星的MIC降至4mg/L,即使再增加环丙沙星诱导浓度,环丙沙星MIC仍然为4mg/L。但是在M9培养条件下,鼠伤寒沙门菌诱导至环丙沙星MIC为1mg/L时,gyrB发生S464Y的突变,进一步诱导至环丙沙星MIC为4mg/L时,在gyr A又额外增加了S83Y的突变,但随后该突变位点消失,即使再增加环丙沙星诱导浓度,环丙沙星MIC仍然为1mg/L。利用RT-PCR技术检测两种血清型突变株外排泵相关基因的表达水平,以确定AcrAB-TolC外排泵是否发生过表达以及与其表达增强相关的调控因子。结果表明肠炎沙门菌耐药突变株的AcrAB-TolC外排活性增强,而鼠伤寒沙门菌耐药突变株AcrAB-TolC外排活性没有明显改变。肠炎沙门菌中RamA作为主要的调控因子对AcrAB-TolC外排泵的表达起到调控作用。采用滴板法检测了不同营养条件下这两种血清型菌株的生长能力,另外也测定了在添加了不同浓度胆盐的情况下两种血清型菌株的生长能力,以确定这两种血清型的菌株在不同环境中的适应性生存能力。结果表明在最初抗生素压力下,肠炎型沙门菌的生长能力显著大于鼠伤寒沙门菌;但是随着抗生素压力的增加及持续,鼠伤寒沙门菌耐药菌株的生长能力显著大于肠炎沙门菌耐药菌株。采用焦磷酸测序法测定同一诱导压力下不同耐药水平的两种血清型沙门菌的竞争能力。结果表明,对环丙沙星敏感的鼠伤寒沙门菌其竞争能力弱于肠炎沙门菌,而耐药的鼠伤寒沙门菌比同一诱导浓度下的肠炎沙门菌更具有竞争能力。另外,也测定了不同胆盐浓度下,鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌对Hela细胞侵袭能力的差异。结果表明,在不加胆盐和0.1%的胆盐浓度下,鼠伤寒沙门菌的侵袭能力弱于肠炎沙门菌,但是在1%胆盐浓度下,鼠伤寒沙门菌的侵袭能力强于肠炎沙门菌。结论:两种血清型沙门氏菌耐药发展机制存在差异,鼠伤寒沙门菌在抗生素选择压力下耐药性的获得除了靶位基因gyrA发生突变,还与除AcrAB-TolC外的其他外排泵作用有关;肠炎型沙门菌耐药性获得主要是由于AcrAB-TolC外排泵的过表达及靶位基因突变所致;当菌株获得环丙沙星耐药表型后的鼠伤寒沙门菌比对肠炎沙门菌更具有适应性优势,而且在高胆盐环境下鼠伤寒沙门菌的侵袭能力强于肠炎沙门菌。
【关键词】：血清型 沙门菌 适应性 耐药性 胆盐
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.61
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 1 前言9-13
• 2 材料与方法13-26
• 2.1 材料13-14
• 2.1.1 样品来源与参考菌株13
• 2.1.2 常规用培养基和试剂13
• 2.1.3 Real-Time PCR用试剂13
• 2.1.4 常用试剂的配制13-14
• 2.1.5 主要仪器设备14
• 2.2 方法14-26
• 2.2.1 菌株复苏14-15
• 2.2.2 体外诱导15
• 2.2.3 二倍琼脂稀释法测定最小抑菌浓度（MICS）15-17
• 2.2.4 QRDR（S）突变的检测17-19
• 2.2.5 细菌生长曲线的测定19
• 2.2.6 突变株中外排泵相关基因表达水平检测19-23
• 2.2.7 生长竞争实验23-24
• 2.2.8 胆盐的耐受24
• 2.2.9 细胞的侵袭24-26
• 3 结果与分析26-37
• 3.1 两种血清型沙门菌QRDR突变和抗生素敏感性的测定26-29
• 3.2 两种血清型沙门菌的生长能力29-31
• 3.3 外排泵相关基因表达水平的检测31-33
• 3.4 生长竞争实验33-34
• 3.5 胆盐的耐受34-36
• 3.6 沙门菌的侵袭能力36-37
• 4 讨论37-42
• 全文总结42-43
• 致谢43-44
• 参考文献44-48

【参考文献】

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1 潘渭涓;陈祥;王晓泉;丛秋霞;潘志明;高崧;焦新安;;1993-2008年禽源大肠杆菌和沙门菌对喹诺酮类药物耐药性分析[J];中国人兽共患病学报;2009年07期

  本文关键词：环丙沙星压力下鼠伤寒和肠炎沙门菌的适应性研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：459403