猪肺泡巨噬细胞M1亚型及猪KLF4基因对PRRSV复制影响的初步研究

发布时间：2017-06-21 06:01

  本文关键词：猪肺泡巨噬细胞M1亚型及猪KLF4基因对PRRSV复制影响的初步研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是最早于1987年在美国首次被发现的一种新型病毒性传染病,是现今世界上危害养猪业最重要的疾病之一。巨噬细胞是一种分布广泛的免疫细胞,可以根据内环境的变化从而极化为不同的类型：经典活化巨噬细胞(M1),以及替代活化巨噬细胞(M2)。猪肺泡巨噬细胞(Porcine alveolar macrophage, PAMs)是PRRSV感染后猪只体内最重要的靶细胞。所以本实验首先通过建立PAMs体外极化模型,研究PAMs极化对PRRSV感染的影响以及PRRSV感染对PAMs影响的动态学变化。实验采用预冷法分离：PAMs,并在体外进行培养,分别用LPS/IFN-γ诱导刺激M1型巨噬细胞；用IL-4诱导刺激分化为M2型巨噬细胞。通过半定量PCR分别检测M1,M2型Marker (M1:IL-1β,IL-12,IL-23和CXCL10; M2: Arg-1, IL-10, PPARy和YM-1)表达量的变化,从核酸水平上证明极化模型的成功。同时用Western blotting从蛋白水平上确定M1型,M2型PAMs的极化成功。之后用500TCID50 HuN4-F5株PRRSV感染极化后的PAMs亚型,在感染后的12,24,36和48h分别通过间IFA和Western blotting对PRRSV的感染量进行测定。结果发现在感染后的12至36h内M1型PAMs中PRRSV的感染量明显低于正常组和M2型PAMs的感染量,而在感染后的48h时M1组中PRRSV的感染量与正常组和M2型PAMs中的感染量基本一致,无显著性的差异。然而PAMs主要通过其表面的模式识别受体(pattern recognition receptor,PRR)发挥其天然免疫防御的功能。那么是否PRRSV感染M1型巨噬细胞对其模式识别受体产生了影响,从而M1型巨噬细胞对PRRSV感染在一段时间内产生了抑制。因此我们通过荧光定量PCR的方法对感染PRRSV的M1型巨噬细胞模式识别受体mRNA的表达量进行了测定,并同时对被认为是巨噬细胞极化的关键调节因子的KLF4基因也进行了测定。而在测定结果中我们意外的发现PRRSV感染极化后M1型巨噬细胞中的KLF4表达量与M1型巨噬细胞对PRRSV复制的影响趋势相似。结果表明感染PRRSV后,随着时间的变化M1型巨噬细胞中KLF4的表达量逐渐降低,在12h达到最低,24h后KLF4的表达量逐渐升高,且在感染后48h时KLF4的表达量与正常组的表达量基本一致,无显著性差异。因此为了进一步研究猪KLF4基因对PRRSV复制的影响,本实验通过PCR技术扩增得到猪KLF4基因,通过TA克隆构建pMD18-T-KLF4重组质粒。酶切鉴定后将KLF4的cDNA亚克隆至pCMV-HA载体,构建重组质粒pCMV-HA-KLF4。转染重组质粒pCMV-HA-KLF4在Marc-145中,12h后感染PRRSV,并在感染后24h通过Western blotting对PRRSV的感染量进行进行测定。结果表明KLF4基因对PRRSV的感染有一定的促进作用。
【关键词】：PRRSV 巨噬细胞极化 模式识别受体 KLF4 真核表达
【学位授予单位】：延边大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.28
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-13
• 前言13-24
• 1 猪繁殖与呼吸综合征概述13-17
• 1.1 猪繁殖与呼吸综合征概述13
• 1.2 猪繁殖与呼吸综合征病毒13-17
• 2 巨噬细胞概述17-22
• 2.1 天然免疫17-18
• 2.2 巨噬细胞18
• 2.3 单核-巨噬细胞系统18-19
• 2.4 巨噬细胞极化19-21
• 2.5 巨噬细胞极化与疾病的相关性21-22
• 3 KLF4及其与病毒感染22-23
• 4 研究目的和意义23-24
• 材料与方法24-36
• 1 材料24-25
• 1.1 试验动物24
• 1.2 试验细胞24
• 1.3 试验病毒24
• 1.4 试验主要试剂24-25
• 2 方法25-36
• 2.1 PAMs的分离培养25
• 2.2 间接免疫荧光鉴定PAMs的纯度25-26
• 2.3 PAMs体外极化刺激处理26
• 2.4 半定量PCR测定极化相关因子mRNA表达水26-28
• 2.5 Western blot检测极化标记分子蛋白表达水平28-29
• 2.6 iNOS活性的测29-30
• 2.7 Arg-1活性的测定30
• 2.8 PRRSV TCID50的测定30-31
• 2.9 PRRSV感染PAMs极化亚型细胞31
• 2.10 荧光定量PCR31-32
• 2.11 猪KLF4基因的PCR扩增32-33
• 2.12 PCR产物的纯化回收33
• 2.13 目的基因KLF4与pMD-18T simple载体重组连接33
• 2.14 重组连接后质粒的转化33-34
• 2.15 重组克隆的筛选34
• 2.16 摇菌34
• 2.17 提取重组克隆质粒34-35
• 2.18 pCMV-HA真核表达质粒的构建35
• 2.19 转染重组质粒PCMV-HA-KLF4在Marc-145细胞中的表达及其对PRRSV复制影P向的初步探索35
• 2.20 数据统计及分析35-36
• 结果36-47
• 1 猪肺泡巨噬细胞(PAMs)纯度的鉴定36
• 2 猪肺泡巨噬细胞(PAMs)体外极化模型的建立36-39
• 2.1 半定量PCR鉴定巨噬细胞的极化状态36-37
• 2.2 iNOS和Arginase-1酶活性的测定37-38
• 2.3 IL-12和Arg-1蛋白含量的检测38-39
• 3 PAMs极化的亚型对PPRSV增殖的影39-40
• 3.1 PRRSV N蛋白间接免疫荧光的观察39
• 3.2 N蛋白的定量分析39-40
• 4 PRRSV感染M1型巨噬细胞对其模式识别受体mRNA表达的影响40-42
• 4.1 感染PRRSV后M1型巨噬细胞模式识别受体mRNA表达40-41
• 4.2 感染PRRSV后M1型巨噬细胞KLF4表达41-42
• 5 猪KLF4基因真核表达载体构建42-46
• 5.1 PCR扩增结果42
• 5.2 重组质粒pMD-18T-KLF4质粒的筛选及鉴定42-43
• 5.3 重组质粒pMD-18T-KLF4的测序分析43-45
• 5.4 重组质粒pCMV-HA-KLF4的酶切鉴定45-46
• 6 转染重组质粒pCMV-HA-KLF4在Marc-145细胞中的表达及其对PRRSV复制影响的初步探索46-47
• 讨论47-50
• 结论50-51
• 参考文献51-57
• 致谢57-58
• 作者简介58-59
• 附录59

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