奶牛乳腺中LAT1基因对乳蛋白生物合成的影响研究

发布时间：2017-06-22 01:13

  本文关键词：奶牛乳腺中LAT1基因对乳蛋白生物合成的影响研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：奶牛在畜牧业中的作用极其重要,牛奶的产量和质量是衡量畜牧业水平的重要标准。我国虽然是世界奶牛养殖大国,但奶牛的平均单产处于世界较低水平。牛奶中的乳蛋白的含量相对较低,无法满足国民消费需求。乳汁是由乳腺中的腺泡分泌细胞产生的。腺泡由分泌上皮细胞构成,这些高度特化的腺泡上皮细胞是奶牛乳腺泌乳的基本单位。筛选对奶牛乳腺发育和泌乳具有调节作用的基因并鉴定这些基因的泌乳调节功能对改善奶牛的泌乳性能、人工调控奶牛乳腺的泌乳能力、促进我国乳业发展具有重要作用。L型氨基酸转运载体1(L-type amino ac id transporter 1,LAT1)是中性氨基酸转运载体,负责转运含有苯环侧链与支链大分子氨基酸进入细胞。LAT1在哺乳动物肝脏、骨髓、大脑、肌肉、胎盘,睾丸、脾脏等组织中均有表达。在乳腺中,LAT1的功能研究在乳腺癌的案例中较多,在正常的乳腺中研究报道较少。为探讨LAT1的表达与奶牛泌乳功能之间的关系,本实验选取泌乳期高乳品质、泌乳期低乳品质和干奶期的中国荷斯坦奶牛,采用荧光定量PCR、Western blot和间接免疫荧光技术研究LAT1在不同泌乳状态及生理状态下的乳腺组织中的表达含量与表达部位变化;并采用基因过表达和干扰技术研究LAT1基因对奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白合成能力的影响。荧光定量PCR和Western blot均显示奶牛乳腺组织LAT1基因在泌乳期高乳品质的乳腺组织中的表达最高,显著高于泌乳期低泌品质和干奶期的奶牛乳腺组织;泌乳期低乳品质的奶牛乳腺组织中LAT1基因的表达也显著高于干奶期的奶牛乳腺组织。间接免疫荧光结果显示泌乳期LAT1主要在乳腺腺泡周围的上皮细胞中表达,虽在腺泡周围结缔组织和脂肪组织的细胞中也检测到LAT1的表达,但表达水平较弱。在干奶期LAT1主要在导管上皮细胞中表达。基因干扰和过表达的结果显示,LAT1基因过表达可以诱导奶牛乳腺上皮细胞中LAT1和β-酪蛋白的表达增加,但4F2hc的表达无显著差异;而LAT1基因干扰则会抑制奶牛乳腺上皮细胞中LAT1和β-酪蛋白的表达,4F2hc的表达没有发生变化。mTOR信号通路是调节蛋白质翻译过程的主要信号通路。为探讨在泌乳的奶牛乳腺上皮细胞中,LAT1的表达是否受到mTOR信号通路的调节,本研究采用雷帕霉素抑制奶牛乳腺上皮细胞内的mTOR信号通路,采用Western blot方法检测mTOR信号通路抑制后奶牛乳腺上皮细胞中LAT1、4F2hc和β-酪蛋白的表达的变化,以及mTOR信号通路相关蛋白mTOR、4E-BP1和P70S6K的表达和活性变化。结果显示雷帕霉素处理的奶牛乳腺上皮细胞中mTOR、4E-BP1和P70S 6K的表达无显著变化,但是p-mTOR、p-4E-BP1和p-P70S6K的表达显著降低,同时LAT1、4F2hc和β-酪蛋白的表达也相应受到抑制。以上研究结果表明LAT1的表达与奶牛乳腺的泌乳能力相关。LAT1在泌乳奶牛乳腺中参与乳蛋白生物合成的调节,同时LAT1的表达受到细胞内mTOR信号通路的调控。该研究结果可以为人工调控泌乳奶牛的乳产量和乳质量提供实验依据,对促进我国乳业的发展具有重要的理论意义。
【关键词】：奶牛 乳腺 LAT1 β-酪蛋白 mTOR
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S823
【目录】：

• 摘要8-9
• 英文摘要9-11
• 1 前言11-15
• 1.1 奶牛乳腺的发育与泌乳11
• 1.1.1 乳腺的发育11
• 1.1.2 奶牛乳腺泌乳机制11
• 1.2 乳蛋白合成的机理11-13
• 1.2.1 乳蛋白的组成及其营养价值11-12
• 1.2.2 乳蛋白的生物合成12
• 1.2.3 乳蛋白合成的调控12-13
• 1.3 L型氨基酸转运载体1的研究进展13-14
• 1.3.1 LAT1基因简介13
• 1.3.2 LAT1的表达13
• 1.3.3 LAT1表达的调节13-14
• 1.4 研究的目的与意义14-15
• 2 材料与方法15-27
• 2.1 实验材料、试剂与仪器15-17
• 2.1.1 实验动物的选取15
• 2.1.2 主要试剂15-16
• 2.1.3 所需试剂的配制16-17
• 2.1.4 主要仪器17
• 2.2 奶牛乳腺组织中LAT1的表达与定位研究17-21
• 2.2.1 荧光定量PCR检测LAT1基因在奶牛乳腺组织中表达17-19
• 2.2.2 Western blot方法检测奶牛乳腺组织中LAT1的表达19-20
• 2.2.3 免疫荧光检测奶牛乳腺组织中LAT1的表达部位20-21
• 2.3 LAT1对奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白合成的影响21-25
• 2.3.1 奶牛乳腺上皮细胞的分离培养21-22
• 2.3.2 奶牛乳腺上皮细胞的鉴定22
• 2.3.3 LAT1基因过表达对乳蛋白合成的影响22-24
• 2.3.4 LAT1基因沉寂对乳蛋白合成的影响24-25
• 2.4 mTOR信号通路对LAT1表达的调节25-26
• 2.4.1 雷帕霉素处理奶牛乳腺上皮细胞25
• 2.4.2 Western blot检测抑制mTOR信号通路对LAT1表达的影响25-26
• 2.5 实验数据的处理分析26-27
• 3 结果与分析27-39
• 3.1 奶牛乳腺组织中LAT1的表达与定位27-31
• 3.1.1 奶牛乳腺组织中LAT1 mRNA的表达27
• 3.1.2 奶牛乳腺组织中LAT1蛋白水平的表达27-28
• 3.1.3 奶牛乳腺组织中LAT1的表达部位28-31
• 3.2 LAT1对奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白合成的影响31-37
• 3.2.1 奶牛乳腺上皮细胞的培养和鉴定31-32
• 3.2.2 LAT1真核表达载体的构建32-33
• 3.2.3 LAT1过表达对奶牛乳腺上皮细胞中乳蛋白合成的影响33-34
• 3.2.4 LAT1基因沉寂对奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白合成的影响34-37
• 3.3 mTOR信号通路对LAT1基因表达的影响37-39
• 4. 讨论39-41
• 4.1 奶牛乳腺组织中LAT1的表达与定位分析39
• 4.2 LAT1基因对奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白合成的影响39-40
• 4.3 mTOR信号通路对奶牛乳腺上皮细胞中LAT1表达的影响40-41
• 5 结论41-42
• 致谢42-43
• 参考文献43-47
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文47

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本文编号：470387