奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌多价毒力因子疫苗的构建及临床试验研究

发布时间：2017-06-22 10:14

  本文关键词：奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌多价毒力因子疫苗的构建及临床试验研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：人们对于奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌疫苗的研究已经进行了几十年的时间了,但针对金黄色葡萄球菌单一的毒力因子的活苗,灭活苗以及基因工程疫苗均未取得显著的免疫效果。本实验的主要目的是先通过分离牛外周血的淋巴细胞克隆得到牛IgG-Fc基因片段,再采用重叠延伸PCR的方法将IgG-Fc基因与本实验室制备好的重组FnBPB-ClfA基因进行串联,构建了串联基因牛Fc-FnBPB-ClfA。将Fc-FnBPB-ClfA克隆到原核表达载体pET32a(+)中,进行目的蛋白的可溶性诱导表达。最后配合铝盐佐剂对10头经CMT检测患有隐性乳房炎的奶牛进行两次免疫。首次免疫选择在奶牛干奶前14天进行肌肉注射免疫,第二次免疫在奶牛干奶的同时进行乳头管注射免疫。免疫分离得到的血清用间接ELISA法检测10头牛的的抗体水平。结果表明,免疫效果良好。在奶牛产犊后开始正常挤奶时再对其进行体细胞数的测定,结果显示10头免疫组牛乳样中的体细胞数均在每毫升10万,证明疫苗的免疫效果良好。本实验通过对感染隐性乳房炎的奶牛免疫获得了良好的免疫效果,为今后奶牛乳房炎疫苗的研究提供了可靠的理论依据。
【关键词】：金黄色葡萄球菌 免疫 奶牛乳房炎
【学位授予单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.23
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-9
• 缩略语表9-10
• 1 前言10-17
• 1.1 病原微生物10
• 1.2 金黄色葡萄球菌的生物学特性10-11
• 1.3 金黄色葡萄球菌的毒力因子11-12
• 1.4 金黄色葡萄球菌粘附素的研究概况12-13
• 1.4.1 凝集因子12
• 1.4.2 纤连素结合蛋白12-13
• 1.5 奶牛乳腺的免疫防御屏障13
• 1.6 FcRn研究进展13-14
• 1.6.1 牛乳中免疫球蛋白13-14
• 1.6.2 FcRn研究进展14
• 1.6.3 FcRn的分子结构14
• 1.7 金黄色葡萄球菌疫苗研究进展14-16
• 1.7.1 全菌灭活疫苗15
• 1.7.2 弱毒活苗15
• 1.7.3 亚单位疫苗15
• 1.7.4 核酸疫苗15-16
• 1.7.5 抗原抗体复合物疫苗16
• 1.8 本研究的目的及意义16-17
• 2 研究一 Fc-FnBPB-ClfA的基因串联17-30
• 2.1 实验材料17-19
• 2.1.1 主要仪器17
• 2.1.2 载体与试剂17-18
• 2.1.3 质粒及血样18
• 2.1.4 实验所需主要溶液18
• 2.1.5 实验流程图18-19
• 2.2 实验方法19-26
• 2.2.1 泌乳奶牛血中分离淋巴细胞19-20
• 2.2.2 牛淋巴细胞中总RNA的提取20
• 2.2.3 反转录20-22
• 2.2.4 牛Fc基因片段回收及纯化22-23
• 2.2.5 重组质粒pMD19T-Fc的构建23
• 2.2.6 重组质粒pMD19T-Fc的PCR鉴定23-24
• 2.2.7 提取重组质粒pMD19T-Fc24-25
• 2.2.8 重组质粒pMD19T-Fc测序25
• 2.2.9 Fc基因与FnBPB-ClfA基因的串联25-26
• 2.2.10 重组质粒pMD19T-Fc-FnBPB-ClfA的构建26
• 2.2.11 重组质粒pMD19T-Fc-FnBPB-ClfA的PCR鉴定26
• 2.2.12 重组质粒pMD19T-Fc-FnBPB-ClfA的提取26
• 2.2.13 重组质粒pMD19T-Fc-FnBPB-ClfA序列测定26
• 2.3 结果26-29
• 2.3.1 牛外周血淋巴细胞总RNA完整性鉴定26-27
• 2.3.2 IgG Fc基因片段的RT-PCR扩增结果27-28
• 2.3.3 重组质粒pMD19T-Fc序列的测定结果及分析28
• 2.3.4 Fc-FnBPB-ClfA串联基因PCR扩增结果28-29
• 2.4 讨论29
• 2.5 小结29-30
• 3 研究二 融合蛋白Fc-FnBPB-ClfA的原核表达30-45
• 3.1 实验材料30-34
• 3.1.1 表达载体30-31
• 3.1.2 主要试剂31
• 3.1.3 主要仪器31-32
• 3.1.4 主要溶液的配制32-33
• 3.1.5 试验流程图33-34
• 3.2 实验方法34-37
• 3.2.1 重组表达质粒pET32a-Fc-FnBPB-ClfA的构建34-35
• 3.2.2 重组蛋白Fc-FnBPB-ClfA的诱导表达及分析35-37
• 3.3 结果37-44
• 3.3.1 重组表达质粒的双酶切鉴定37-38
• 3.3.2 重组表达质粒pET32a-Fc-FnBPPB-ClfA序列的测定结果及分析38-41
• 3.3.3 重组蛋白最佳诱导时间的确定41
• 3.3.4 重组蛋白最佳诱导剂浓度确定41-42
• 3.3.5 重组蛋白的可溶性鉴定42-43
• 3.3.6 重组目的蛋白的纯化43
• 3.3.7 重组蛋白浓度测定结果43-44
• 3.4 讨论44
• 3.4.1 表达系统的选择44
• 3.5 小结44-45
• 4 研究三 重组蛋白Fc-FnBPB-ClfA配合铝盐佐剂对本动物免疫学的研究45-53
• 4.1 实验材料45
• 4.1.1 实验动物45
• 4.1.2 重组蛋白与试剂45
• 4.2 实验方法45-53
• 4.2.1 制备铝盐佐剂与重组蛋白Fc-FnBPB-ClfA的混合疫苗45
• 4.2.2 奶牛的免疫程序45
• 4.2.3 牛乳中体细胞数的测定45-46
• 4.2.4 牛乳中体细胞数的测定的结果46
• 4.2.5 牛血清中Fc-FnBPB-ClfA抗体的测定46
• 4.2.6 免疫奶牛血清ELISA抗体水平检测结果46-53
• 5 总体讨论与结论53-55
• 5.1 总体讨论53
• 5.2 总体结论53-55
• 致谢55-56
• 参考文献56-60
• 作者简介60

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本文编号：471481